Как расшифровывается имя рамиль: Имя Рамиль на Имя.Ком. Значение и происхождение имени Рамиль.

Содержание

значение, краткая характеристика. Тайна имени Дина

Для ознакомления с народными обычаями и поверьями

Звонкое женское имя Дина существует само по себе, хотя многие ошибочно полагают, что это сокращение от другого имени – Диана. Возникло это имя от греческого слова «динамис», означающего «мощь», «сила».

Достаточно воинственное имя наделяет девочку мужскими чертами характера. Можно сказать, что многие Дины подвижны, активны, решительны, напористы. К тому же они склонны к интригам, различным авантюрам, необдуманным действиям. Женщинам с этим именем характерно сделать что-либо, а потом уже думать о содеянном поступке. Такой подход нередко приносит неприятности.

Из-за своего темперамента Дина всю жизнь стремится к каким-либо целям, при этом старается выполнить задачу в кратчайшие сроки. Хандра и грусть иногда одолевают Дину, но это очень быстро проходит. Подобные перемены настроения могут происходить по несколько раз в день.

Детство

Если приводить значение имени Дина для ребенка, то следует отметить, что в этом возрасте девочка чрезвычайно мила, весела, общительна и эмоциональна. Но перемены настроения заметны даже в маленьком ребенке. При этом Дине нравится заботиться о ком-то, в частности о животных. Если же кому-то из друзей понадобится помощь, то она обязательно окажет ее.

В конфликтных ситуациях она не растеряется и постоит за себя, так что в обиду Дина себя не даст. Окружение питает к ней некую снисходительность, чем она и пользуется. Вплоть до старшего возраста она будет маленькой беззащитной девочкой. Детство для нее продолжается достаточно долго, причем выражается это не только в поведении, образе жизни и характере, но и даже в одежде, в которой обязательно будут цветочки, рюши, банты. Ей комфортно в этом состоянии, и она не торопится выходить из зоны комфорта.

Можно сказать, что большая доля наивности у Дины преобладает с детства, а остальная наиграна, так как ей это выгодно. По этой причине родителям стоит обратить внимание на эту особенность характера, чтобы в дальнейшем девочка не выросла двуличной.

Характер взрослой Дины

Став старше, Дина становится более строгой, но о привлекательности и женственности она не забывает. Эмоциональность в ней преобладает настолько, что для доказательства искренности своих чувств она может играть на публику.

Рассматривая имя Дина, значение его, следует отметить, что во взрослом возрасте девушка становится убежденной максималисткой. Для нее нет золотой середины, ведь все должно быть либо идеально, либо никак. Для Дины нет авторитетов, так как она сама путем проб и ошибок прокладывает нелегкий путь.

Нередко она обладает аналитическим складом ума. Эти женщины способны ко взвешенному анализу фактов. Определяя, что значит имя Дина, стоит указать его перевод с арабского – «вера». Скорее всего, по этой причине эти девушки склонны к максимализму и самоотверженности.

Работа

В карьере значение имени Дина указывает лишь на положительные стороны. Ей важно направить всю свою энергию на результат. Ей подходят те профессии, где требуются быстрая реакция, коммуникабельность, выдержка. Дина заскучает на монотонной работе, где основными критериями являются кропотливость, усидчивость и терпение. В общем, идеален вариант с журналистикой, рекламой, фотографией, сферой обслуживания и так далее.

Дина – настоящая карьеристка, которая отдает своей работе максимум усилий. Не погнушается она и нечестных методов на пути к своей цели.

В коллективе Дины пользуются авторитетом как у сотрудников, так и у начальства. Довольно часто их ставят в пример другим работникам. Благодаря тому что работа выбирается по увлечениям, Дина практически всегда достигает высот в карьере. Отчасти успех обусловлен и ее прекрасно развитой интуицией.

Брак

Перейти на новую ступень отношений Дина сможет лишь в том случае, если будет уверена, что супруг сильнее ее. Так она сдает свои позиции лидера, передавая главенствующую роль мужу. В браке она реализует себя в качестве хорошей домохозяйки и любящей матери. На этом этапе приоритетом становится комфорт близких для нее людей. Но это лишь благоприятных исход отношений.

Часто Дины рано влюбляются и выходят замуж. Также нередко их брак заканчивается разводом. По этой причине среди представительниц этого имени можно встретить матерей-одиночек. А причиной является именно характер, который с возрастом только усугубляется. Несмотря на все хорошие качества, Дина может быть категоричной, резкой и колкой, а своими высказываниями обидеть близких людей.

Для брака Дине более всего подойдет мужчина, носящий одно из следующих имен: Артур, Олег, Владислав, Виктор, Богдан, Денис, Игорь, Иван и другие. Отношения вряд ли сложатся с Валерием, Григорием, Русланом, Тимуром, Валентином, Марком, Матвеем и т. д.

Положительные качества

Мудрость и честность, настойчивость и обдуманность принятых решений — всем этим наделено имя Дина. Значение указывает и на самоотверженность девушки в такой степени, что она оказывает помощь и в тех случаях, когда о ней не просят. К положительным качествам можно отнести и любовь к животным, о которых она с удовольствием заботится.

Отрицательные стороны

Как указывала выше характеристика имени Дина, эти девушки очень эмоциональны. По этой причине они часто обижаются по пустякам, но не отмалчиваются, а ругаются. В детском возрасте это доставляет немало хлопот близким людям. Кроме этого, Дины могут быть довольно мстительными, злопамятными, самовлюбленными. Высказывают все свои обиды, как правило, они в наиболее неподходящий для этого момент. Из-за таких черт характера Дины могут испортить отношения с близкими людьми, ведь они не признают авторитетов и всегда считают себя правыми.

Нумерология

Рассматриваем далее имя Дина. Значение в нумерологии немного иное, нежели в астрологии.

Число Души – 4. В нумерологии тайна имени Дина расшифровывается иначе. Обладатели этого числа склонны к точным, а не гуманитарным наукам. Из этих людей получаются отменные проектировщики, научные работники, инженеры. Они достаточно надежны, стабильны и добросовестны. Благодаря положительным качествам, их уважают коллеги и друзья.

Люди этого числа не склонны к вражде. Не стоит ожидать от них каких-либо неожиданных поступков и творческих проявлений характера. Их жизнь рассчитана по минутам, и они не любят изменений плана. Несмотря на скупость эмоций, люди «четверки» надежны и верны в любых жизненных ситуациях. В детстве они очень послушны, а становясь родителями, приобретают строгость, иногда даже чрезмерную.

Астрологическая совместимость имени Дина

  • Планета-покровитель: Сатурн.
  • Зодиакальное соответствие: Весы.
  • Черты характера: обаяние, настойчивость, целеустремленность.
  • Цвета имени: коричневый, красный.
  • Счастливые цвета: зеленый, фиолетовый.
  • Камень-талисман: хризопраз, аметист.

Знаменитости

Дина Умарова – индийская актриса; Дина Шор – американская актриса; Дина Сассоли – итальянская актриса; Дина Мигдал – российская певица, поэтесса; Дина Мейер – американская киноактриса.

Имена.

АаронОт древнееврейского имени Ахарон — «высокий, гора, гора света, учитель, возвышенный; ковчег завета»
АвгустинаЖенская форма от Августин, происходящего от римского императорского титула augustus — «величественный», «величайший»
АвдейОт древнееврейского имени Обадьяху — «слуга Божий», «служитель Бога»
Авраам«Отец народов». Древнееврейское имя.
АврораОт имени римской богини Авроры — «рассвет», «утреняя заря»
АгатаВариант мужского имени Агапий (Агапит), происходящего от греческого агапе — «любовь»
АглаяОт древнегреческого имени Аглаиа — «красота», «блеск», «радость»
АгнессаОт древнегреческого имени Хагне, происходящего от хагне — «невинная», «непорочная»
АгнияДословный перевод имени с латинского языка — «овечка». Означает чистоту и непорочность. Агния — русское имя.
АгриппинаЖенская форма от Агриппин, происходящего от римского родового имени Agrippa, происходящего от древнегреческого агриос — «дикий» + хиппос — «лошадь»
АдаКраткая форма имени Аделаида, происходящего от древнегерманского имени Adalheid (Adelheid): adal, athal — «благородный» + heit — «состояние, род, сословие»
древнееврейское имя, форма имени Адена — «украшение»
АдамОт древнееврейского имени Адам, что в переводе означает «человек»
АделаидаОт древнегерманского имени Adalheid (Adelheid): adal, athal — «благородный» + heit — «состояние», «род», «сословие»
АдельОт французского имени Adèle, происходящего от древнегерманского имени Adala (Adela) — «благородная»
АдиляВ переводе с арабского языка — «справедливая», «честная»
АдрианОт римского родового имени Hadrianus — «адриатический», «тот, кто родом с берегов Адриатического моря»
форма мужского имени Андрей, с древнегреческого — «сильный», «мужественный»
АдрианаЖенская форма от Адриан, происходящего от римского родового имени Hadrianus — «адриатический», «тот, кто родом с берегов Адриатического моря»
АзаВ переводе с древнееврейского языка — «твердая», «уверенная»
в переводе с арабского языка — «утешение»
одна из форм женского имени Азалия и мужских имен Азат, Азадан, Азарий
АзатПо арабской версии от среднеперсидского (пехлеви) Yazata (Азат) — «свободный», «независимый»
от армянского азат — «помещик»
АзизаВ переводе с арабского языка — «редкая», «ценная», «дорогая», «милая»
АидаВ переводе с арабского языка — «гостья», «возвращающаяся»
АифалОт древнегреческого eytales — «бессмертный»
АкакийОт древнегреческого имени Акакиос — «незлобивый, не делающий зла»
АкилинаОт латинского aquilinus — «орлиный»
АкимФорма имени Иоаким, изначально древнееврейского имени Йехояким — «созданный Яхве (Богом)», «утвержденный, поставленный Яхве»
производное от арабского имени Хаким — «умный», «образованный», «мыслящий», «ученый», «мыслитель», «мудрец»
форма японского имени Акихито
Акулина«Орлица», «орлиная». Это древнеримское имя. К нам пришло с христианством из Византии. Вначале было распространено в основном среди служительниц церкви, затем этим именем стали называть своих детей простые жители.
АланаЖенская форма от Алан:
в переводе с кельтского — «скала»
в переводе с иранского — «божественный», «благородный»
от названия племени аланов, кочевавшего от Кавказа до Испании
АлевтинаВариант имени Валентина, происходящего от мужского имени Валентин (от латинского Valens) — «сильный, крепкий, здоровый»
АлександрОт древнегреческого имени Александрос: алекс — «защищать» и андрос — «мужчина», «человек»
АлександраЖенская форма от Александр, происходящего от древнегреческого имени Александрос: алекс — «защищать» и андрос — «мужчина», «человек»
АлексейОт древнегреческого имени Алексиос — «защитник»
АленаОт древнегреческого имени Хелене — «факел, светоч»
АлиВ переводе с арабского — «высокий», «возвышенный», «надменный», «старший»
АлимВ переводе с арабского — «ученый»
АлинаОт французского имени Aline (Алин)
в переводе с латинского языка — «другая», «чужая»
форма имени Аделина, в переводе со скандинавского языка — «благородная», «величественная», «великодушная»
форма латинского имени Альбина (от латинского albus) — «светловолосая», «светлая», «белая»
АлисаОт старофранцузского имени Alis, краткой формы имени Adelais, происходящего от древнегерманского имени Adalheid (Adelheid): adal, athal — «благородный» + heit — «состояние, род, сословие»
от латинского alis — «крылья»
АлияАрабское имя, женская форма от Али — «возвышенная», «высокая»
АллаОт древнегреческого алле — «другая», «иная»
от древнегерманского имени Alla (Alle), краткой формы имен, содержащих элемент al — «все», «весь»
от доисламской богини Аллат, в переводе с арабского языка — «богиня»
в переводе с древнееврейского — «богиня», «фисташковое дерево»
АлсуВ переводе с татарского — «розовый цвет»
АльбертОт древнегерманского имени Adalberht: adal, athal — «благородный» и beraht, berht — «светлый»
АльбинаОт римского родового имени Albinus, происходящего от латинского слова аlbus — «белый»
АльфредОт древнеанглийского имени Ælfræd: ælf — «эльф» и rǣd — «совет»
АмалияОт древнегерманского имени Amalia, происходящего от amal — «работа», «труд»
форма имени Эмили, в переводе с латинского языка -«соперница», «достойный противник»
форма имени Амал, в переводе с древнееврейского — «трудолюбивая», с арабского языка — «надежда», «ожидание», «стремление»
АминаОт имени матери Пророка Мухаммада — «надежная», «верная», «честная», «со спокойным нравом», «находящаяся в спокойном, безопасном месте»
АнастасияЖенская форма от Анастасий, происходящего от древнегреческого имени Анастасиос — «воскресший»
АнатолийОт древнегреческого имени Анатолиос, происходящее от анатоле — «восточный», «восток», «восход солнца», «рассвет»
так называли жителя Анатолии (древнее название Малой Азии, расположенной на востоке от Греции)
АнгелинаОт позднелатинского мужского имени Ангелус, происходящего от греческого ангелос — «ангел», «вестник»
АндрейОт древнегреческого имени Андреас, происходящее от андрос — «мужчина», «человек»; также существует перевод «мужественный», «смелый», «отважный»
АнжелаОт позднелатинского мужского имени Ангелус, происходящего от греческого ангелос — «ангел», «вестник»
АнжеликаОт латинского angelicus — «ангельский», происходящего от греческого ангелос — «ангел», «вестник»
АнисияЖенская форма от Анисий, происходящего от древнегреческого имени Анюсиос (от латинского анюсис) — «исполнение», «завершение»
АнитаВ переводе с испанского языка — «грациозная», «изящная»
АннаОт древнееврейского имени Ханна — «милость», «благодать», «сила», «храбрость»
АнтонОт римского родового имени Antonius, происходящее от древнегреческого антао — «встречаться, сталкиваться», «вступать в бой», «состязаться» или антос — «цветок»
АнтонинаОт греческого слова антао — «вступающая в бой», «состязающаяся в силе», «противница», «противостоящая», «достойная похвалы» или антос — «цветок»
АнфисаОт древнегреческого имени Антуса, происходящего от антос — «цветок»
АполлинарияЖенская форма от Аполлинарий, происходящего от латинского имени Apollinaris — «Аполлонов, принадлежащий Аполлону»
АполлонОт имени греческого бога Аполлона, происходящего от древнегреческого апелао — «отвращающий» либо апелла — «собрание»
АрамБиблейское имя: Арам — сын Сима, внук Ноя
в переводе с армянского языка — «благородный», «милосердный»
в переводе с персидского языка — «утешение», «покой»
АриаднаОт древнегреческого имени Ариадне, происходящего от ари — усилительный префикс «пре-» + адне — «непорочная», «чистая», «священная»
АринаОт древнегреческого имени Эйрене — «спокойствие», «мир», «покой»
АристархОт древнегреческого имени Аристархос: аристос — «наилучший» и архос — «правитель»
АркадийОт древнегреческого имени Аркадиос -«аркадец, житель Аркадии (область в Греции)», а также «счастливый», «блаженный»
от греческого слова «аркадос» — «пастух»
АрманОт немецкого имени Герман — «воин», «сильный мужчина»
в переводе с древнеперсидского- «мечта», «заветное желание»
АрменЧасто его переводят как «армянин», «армянский мужчина», «житель Армении»
от немецкого имени Герман — «воин», «сильный мужчина»
вариант имени Арминий, которое происходит от латинского имени Arminius, образованное от немецкого Irmin — «великий»
АрсенийОт древнегреческого имени Арсениос, происходящее от слова арсен — «мужественный, зрелый»
АрсенияЖенская форма от Арсений, происходящего от древнегреческого имени Арсениос (от слова арсен) — «мужественный, зрелый»
АрсланВ переводе с тюркского языка — «лев»
АртемОт древнегреческого имени Артемиос, происходящее от имени богини Артемиды — «посвященный Артемиде» либо от слова артемес — «невредимый, здравый», «безупречного здоровья»
АртемийАртемий — посвященный Артемиде, богине охоты и луны. Имя древнегреческое.
АртурОт кельтского имени Arthur, происходящее от arto — «медведь», «камень»
от греческого названия звезды Арктур — «страж медведицы»
от латинского слова artus — «сила, мощь»
АрхипОт древнегреческого имени Архиппос — «властвующий над лошадьми, управляющий лошадьми»
АсяВ переводе с древнегреческого — «горожанка»
АурелияОт латинского слова aurum — «золото»
АфанасийОт древнегреческого имени Атанасиос, происходящее от слова атанатос — «бессмертный»
АхмедВ переводе с арабского языка — «достойный похвалы», «наиславнейший», а также «тот, кто постоянно благодарит Бога»
АшотВ переводе с армянского языка — «надежда этого мира»
в переводе с тюркского языка- «не боящийся огня», «играющий с огнем», «озорник»
БеатаВ переводе с латинского языка — «блаженная», «счастливая»
БеллаВ переводе с латинского — «прекрасная», «красавица»
от итальянского bella — «прекрасная»
БертаКраткая форма имен, оканчивающихся на германский элемент bert/berht — «светлый», «свет»
БогданОт древнерусского «Богъ» (Бог) + «даный» (данный) — «данный Богом», «Божий дар», «дарованный Богом»
БогданаЖенская форма от Богдан — «данная Богом»
БоженаСлавянское происхождение — «благословенная», «божья»
БорисОт старославянского имени Борислав — «борец», «славный в борьбе»
от тюркского барыш — «выгода»
БулатОт персидского слова фулад — «стальной»
от тюркского болот — «сталь»
ВадимОт древнерусского вадити — «спорить, сеять смуту» либо «приручать»
от древнерусского слова волод — «правитель»
краткая форма имени Вадимир — «спорить»
ВалентинОт римского родового имени Valentinus, происходящее от другого родового имени — Valens — «сильный, крепкий, здоровый»
ВалентинаОт мужского имени Валентин, происходящего от латинского Valens — «сильный, крепкий, здоровый»
ВалерийОт римского родового имени Valerius — «быть сильным, здоровым»
ВалерияЖенская форма от Валерий, происходящего от римского родового имени Valerius — «быть сильным, здоровым»
ВарвараОт древнегреческого имени Барбара, происходящего от барбарос — «не говорящий по-гречески», «не грек», «чужеземный», а также «грубый», «жестокий»
ВарфоломейОт имени Бартоломайос — древнегреческой формы арамейского имени Бар-Талмай — «сын Талмая»
ВасилийОт древнегреческого имени Басилейос — «царский, царственный»
ВасилисаОт древнегреческого имени Басилисса — «царица», «царственная»
ВенераОт имени римской богини Венеры — «милость богов»
от латинского venus — «любовь», «красота», «прелесть», от слова venero — «украшать» либо от veneror — «чтить», «молить», «умолять»
от испанского Venera — «раковина (моллюска)»
ВениаминОт древнееврейского имени Биньямин — «сын правой руки»
ВераОт древнегреческого имени Пистис — «вера»
ВероникаОт древнегреческого имени Ференике: феро — «нести», «приносить» + нике — «победа»
ВеселинаСлавянское происхождение — «веселая», «жизнерадостная»
ВестаСлавянское происхождение — «известие»
Викентий«Преуспевающий», «побеждающий».
ВикторОт латинского слова victor — «победитель»
ВикторияОт латинского victoria — «победа»
Вилли«Воля, желание». Европейское имя.
ВиолеттаОт латинского viola — «фиалка»
ВиринеяВ переводе с латинского — «цветущая», «молодая»
Виссарион«Дающий жизнь людям», «лесной». Древнегреческое имя.
ВитаОт латинского слова vita — «жизнь»
ВиталийОт римского родового имени Vitalis — «жизненный, полный жизни»
ВиталинаЖенская производная форма от Виталий, происходящего от римского родового имени Vitalis — «жизненный, полный жизни»
ВладимирОт древнерусского имени Володимѣръ — «володѣти» (владеть) + «мир»
от древнескандинавского имени Valdimárr: valdr — «властелин, правитель» + mærr — «знаменитый, славный»
ВладиславОт древнерусских слов «володѣти» (владеть) + «слава»
ВладиславаЖенская форма от Владислав, происходящее от древнерусских слов «володѣти» (владеть) + «слава»
ВладленСокращенно от «Владимир Ленин»
ВладленаЖенская форма от Владилен (Владлен), происходящего от сокращения «Владимир Ленин»
ВольдемарОт немецких слов: waltan — «управлять, властвовать» и maren — «известный, великий», т. е. «знаменитый властитель»
немецкий аналог имени Владимир — «владеющий миром»
ВсеволодОт древнерусских вьсь — «весь» + володѣти — «владеть», т.е. «владеющий всем», «всевластный»
ВячеславОт древнерусских вяче — «больше, более» + «мир», т. е. «самый славный», «более славный»
ГабриэллаЖенская форма от Габриэль (Гавриэль) — «помощник Бога», «сильный человек Бога», «Божья твердыня»
ГавриилОт древнееврейского имени Габриэль — «сильный человек Бога, Божий воин»
Галактион«Молочный». Имя Галактион древнегреческое.
ГалинаОт древнегреческого имени Галене — «спокойствие», «тишина», «штиль (на море)»
ГарриОт старофранцузского имени Генри — «сильный и богатый»
ГеворгАрмянская форма имени Георгий — «земледелец»
ГеннадийОт древнегреческого имени Геннадиос, происходящее от геннадас — «благородный, высокорожденный»
ГенрихОт немецкого имени Heinrich (Хайнрих), происходящее от древнегерманского имени Heimerich: heima, hem — «дом, жилище, поместье» + rihhi, riki — «богатый, могущественный; вождь, правитель», т. е. властелин двора, глава в доме
ГеоргийОт древнегреческого имени Георгиос, происходящее от георгос — «земледелец», «возделывающий землю»
Герасим«Уважаемый». Имя Герасим пришло в Россию из Византии вместе с христианством.
ГерманОт латинского germanus — «братский, близкий», «единокровный, родной», «настоящий, истинный, подлинный»
один из вариантов написания и произношения древнегерманского имени Германн (Херманн) — «воин»
ГлафираОт древнегреческого имени Глафюра, происходящего от глафюре — «гладкая», «изящная», «красивая»
ГлебОт древнескандинавского Готлиб — «наследник бога», «любимец богов», «под защитой богов»
от древнегерманского Gottlieb: got — «бог» + lieb — «любовь»
от славянских слов глоба, глыба — «жердь» или глеба — «почва», «земля»
ГликерияЖенская форма от Гликерий, происходящего от древнегреческого имени Глюкериос (от слова глюкерос) — «сладкий»
ГордейОт древнегреческого Гордий — «властелин», «царь», «повелитель»
от греческого имени Горгий — «быстрый», «грозный»
славянское имя — «гордец», «гордый»
ГригорийОт древнегреческого григорео — «бодрствовать», «быть бдительным», «не спящий»
ГузельФорма имени Гюзел, в переводе с тюркского языка — «прекрасная», «красавица»
ГульназОт сочетания двух слов: гул -«цветок» и наз — «нежность», «ласка»
ДавидОт древнееврейского имени Давид — «любимый»
ДамирПо арабской версии — «настойчивый», «железный»
вариант татарского имени Тимер (Тимур, Димер) — «железо»
краткая форма славянского имени Далимир (Далемир, Далимил) — «дающий мир», «приносящий спокойствие», «основатель вселенной (мира)»
советское, революционное имя — сокращение лозунга «Да здравствует мир» или «Даешь мировую революцию»
ДанаОдна из форм еврейского мужского имени Даниил — «Бог мой судья»
славянское имя — «дарованная»
современная форма имен Деница, Даница, происходящие от общеславянского денница — «утренняя звезда»
краткая форма женского имени Данута, происходящее от литовского «дочь неба» либо от латинского donata — «данная», «дарованная»
от имени ирландской (кельтской) богини созидания Дану
ДаниилОт древнееврейского имени Данийель — «Бог мой судья»
ДаниэлаЖенская форма мужского имени Даниэль (Дэниэл) — «Бог мой — судья»
ДаниярВ переводе с тюркского — «дар солнца»
в переводе с персидского — «умный», «обладающий знаниями»
ДарьяОт имени Дарейос, происходящего от древне-персидских слов dāraya — «держать», «обладать» + vau — «добро»
славянское имя, происходящее от слова дар — «дарованная», «подаренная»
одна из форм женского имени Даррен, в переводе с ирландского языка — «скалистая гора», «невысокий»
ДементийОт латинского — «укротитель», «усмиряющий»
ДемидОт древнегреческого имени Диомедес: диос — «Зевсов, принадлежащий Зевсу, божественный» + медомай — «думать, заботиться»
ДемьянОт древнегреческого имени Дамианос, происходящее от дамазо — «приручать, подчинять, смирять» либо от имени богини плодородия Дамии
ДенисОт древнегреческого имени Дионисиос — «принадлежащий богу Дионису»
ДжамалПо арабской версии — «раб Аллаха», «совершенный, красивый»
ДжулияВ переводе с латинского — «из рода Юлиев», «июльская»
от древнегреческого иулос — «кудрявая», «пушистая»
ДианаОт имени римской богини луны и охоты Дианы — «божественная»
ДинаОт древнееврейского имени Дина — «суженая»
от арабского дин — «вера»
от древнегреческого динамис — «сила»
ДинараОт арабского слова динар — «драгоценная монета»
ДмитрийОт древнегреческого имени Деметриос — «посвящённый Деметре (богине плодородия)», «земледелец»
ДоминикаОт женской формы позднелатинского мени Dominicus — «Господня, та, кто принадлежит Господу»
ЕваОт древнееврейского имени Хава, происходящего от хавах — «дышать» или от хаях — «жить»
ЕвгенийОт древнегреческого имени Эугениос, происходящее от эугенес — «с хорошими генами», «благородный, из хорошего рода»
ЕвгенияЖенская форма от Евгений, происходящего от древнегреческого имени Эугениос (от слова эугенес) — «с хорошими генами», «благородный, из хорошего рода»
Евдоким«Славный». Имя Евдоким переводится с древнегреческого, как «славный», подобно большинству русских имен, имеет византийское происхождение. Этим именем нередко именовали мужчин при пострижении в монахи.
ЕвдокияОт древнегреческого имени Эудокиа — «благоволение»
ЕвлалияОт древнегреческого имени Эулалиа — «красноречивая», «хорошо говорящая»
ЕвстолияВ переводе с древнегреческого — «хорошо одетая», «благодеянная»
ЕгорРусский вариант древнегреческого имени Георгий — «земледелец», «возделывающий землю»
ЕкатеринаОт греческого имени Экатерини, происходящего от древнегреческого катарос — «чистая»
ЕленаОт древнегреческого имени Хелене — «светлая»
ЕлизаветаОт древнееврейского имени Элишеба — «мой Бог — клятва», «почитающая Бога»
ЕлизарОт древнееврейского имени Элеазар — «Бог помог»
ЕлисейОт древнееврейского имени Элиша — «Бог — спасение»
один из вариантов произношения имени Одиссей, происходящее от греческого имени Одюссеус — «сердитый», «гневный»
ЕмельянРусская форма имени Эмиль, которое произошло от римского родового имени Aemilius, происходящее от латинского слова aemulus — «соперник», «ревностный, страстный», «неуступчивый»
ЕремейРусский вариант имени Иеремия, происходящее от древнееврейского имени Йирмияху — «Яхве вознес»
ЕсенияОт славянского мужского имени Есений — «осень»
от славянского имени Весна
от фамилии известного русского поэта Сергея Есенина
созвучное имени Ксения, в переводе с древнегреческого — «гостья», «чужестранка»
от арабского мужского имени Хасан — «хорошая», «красивая»
ЕфимОт древнегреческого имени Эутюмиос, происходящее от слова эутюмос — «доброжелательный, благосклонный, предвещающий добро»
Ефрем«Плодовитый». Имя Ефрем имеет древнееврейские корни, является русской формой семитского имени Эфраим. В Библии так звали одного из родоначальников 12 колен Израилевых.
ЕфросиньяОт древнегреческого имени Эуфросюне — «веселье», «радость»
ЖаннаОт французского имени Jeanne — женской формы от Jean, происходящего от древнееврейского имени Йоханан -«Яхве милостив»
французская вариация имени Иоанна, в переводе с древнееврейского языка — «милость Божья», «дар Богов», «благодать»
ЖасминВ переводе с древнеперсидского — «ветка жасмина», «цветок жасмина», в переносном смысле — «благоуханная», «подарок богов»
ЗараОдна из современных форм произношения славянских имён Зарина и Заря — «заря»
в переводе с арабского языка — «утренний рассвет»
в переводе с армянского языка — «жрица храма огня»
ЗахарФорма имени Захарий, Захария, происходящее от древнееврейского имени Зехарья (Зехариаху) — «Господь вспомнил» («Яхве вспомнил»), «памятный Господу», «вспомянутый Господом», «помнящий Господа»
ЗемфираВ переводе с тюркского — «непокорная»
в переводе с иранского — «сапфир», «драгоценный камень»
от древнегреческого названия теплого ветра Зефира — «теплая», «воздушная»
ЗинаидаОт древнегреческого имени Зенаис — «принадлежащая Зевсу», «из рода Зевса, Зевсова»
в переводе с латинского языка — «заботливая»
в переводе с арабского языка — «красивая»
Зиновий«Богоугодно живущий». История появления этого имени начинается от древнегреческого слова «зенобиос», что означает «Зевс» и «Биос», то есть жизнь. Имя пришло из Византии.
ЗлатаОт древнегреческого слова хриса — «золотая», «золотко»
в переводе с древнееврейского — «золото»
ЗояОт древнегреческого имени Зоэ — «жизнь»
ИбрагимПо арабской и тюркской версии — «пророк»
арабская форма имени Авраам, в переводе с еврейского — «отец народов», «родоначальник»
ИванОт древнееврейского имени Йоханан — «Яхве милостив»
от древнеиудейского Иоанн — «помилованный Богом»
ИваннаЖенская форма от Иван (Иоанн), в переводе с древнеиудейского — «помилованная Богом»
ИветтаЖенская форма древнегерманского имени Иво — «тис», «тисовое дерево»
ИгнатОт римского родового имени Egnatius, происходящее от латинского ignis — «огонь»
Игнатий«Огненный». Имя давалось ребенку, чтобы уберечь его от злых духов, так как делало рождение малыша незаметным для темных сил. Имя пришло из Византии. Есть версии, что это имя ведет начало от латинского «игнатус» — «незнаемый», «неведомый».
ИгорьОт древнескандинавского имени Ингвар — «воин бога Инга», «воинственный», «хранитель бога-громовержца»
от старославянского игрь — «игра, веселье, забава»
ИдаОт древнегерманского имени Ida (Ita, Itha), происходящего от it — «трудолюбивая», «усердная»
ИзабеллаОт провансальского имени Isabeu, формы имени Елизавета, в переводе с древнееврейского языка — «посвященная Богу», «Бог — моя клятва»
ИисусГреческая форма еврейского имени Иешуа — «Бог — спасение»
ИларионИмя Иларион переводится с древнегреческого как «веселый».
ИларияОт латинского имени Hilarius, происходящего от древнегреческого хиларос — «радостный», «веселый»
ИлларионОт древнегреческого имени Хиларион, происходящее от хиларос — «радостный, веселый»
ИлонаВенгерский вариант греческого имени Елена — «светлая»
ИльдарОт тюрко-персидских слов ил — «государство» и «дар» — «обладать», т. е. «правитель», «предводитель»
ИльхамПо арабской версии — «вдохновение», «творческий порыв»
ИльяОт древнееврейского имени Элияху — «мой Бог — Яхве»
ИльясАрабская форма древнееврейского имени Элияху — «мой Бог — Яхве»
ИнараВ переводе с древнегреческого — «избранная»
в переводе с арабского языка — «проблеск света», «посланная Богом»
ИнгаОт одного из имен скандинавского бога плодородия Фрейра — Инг (Ing) — «находящаяся под защитой Ингви (Инги)»
краткая форма немецкого имени Ингеборга: Ing -одно из имен бога Фрейра + bjorg — «помощь», «защита»
женский аналог мужского имени Ингвар или Инго, Ингольф, в русском языке имени Игорь
ИннаОт латинского inno — «плавающая», «течь», «плавать», «протекать», «бурный поток»
ИннокентийОт латинского innocens — «безвредный, невинный, безобидный»
ИосифОт древнееврейского имени Йосеф — «Яхве воздаст»
ИраидаОт древнегреческого имени Хераис — «из рода Геры», «дочь героя», «героиня»
ИраклийОт древнегречееского имени Хераклейос — «Гераклов, принадлежащий Гераклу»
ИринаОт древнегреческого имени Эйрене — «спокойствие», «мир», «покой»
ИрмаКраткая форма древнегерманских имен, начинающихся c компонента ermen — «всеобщий»
в честь почитавшегося многими древнегерманскими племёнами бога Ирмин
ИсаакийВ переводе с иврита — «смеяться, смех». Исаакий — имя, производное от Исаака, древнееврейское.
ИскандерАрабский вариант греческого имени Александр — «защитник»
ИсмаилОт древнееврейского имени Йишмаэль — «Бог услышит»
ИяВ переводе с древнегреческого языка — «фиалка»
КалерияОт древнегреческого кале — «прекрасная», «красивая»
КамиллаОт римского родового имени Camillus, происходящего от латинского camillus — «юноша, посвященный служению богам»
КамильОт римского родового имени Camillus, которое произошло от camillus — «юноша, посвященный служению богам»
вариант звучания арабского имени Камил (Камал, Камаль) — «совершенный», «лучший»
КапитолинаОт римского родового имени Capitolinus — «капитолийский», «относящийся к Капитолийскому холму»
КаренОт арабского имени Карим — «великодушный, щедрый»
в переводе с арабского языка — «проповедник»
КаринаОт римского родового имени Carinus, происходящего от латинского carus — «милый», «дорогой»
от древнегреческого имени Коринна, происходящего от коре — «девушка»
от арабского имени Карима — «великодушная», «щедрая»
КаролинаЖенская производная форма от древнегерманского имени Карл, происходящего от karl — «человек», «муж», «мужчина»
КарпВ переводе с древнегреческого — «Плод». Точное происхождение установить не удалось. Но есть версия, что первым носителем имени был Св. апостол Карп — один из семидесяти апостолов Иисуса Христа.
КатаринаФорма древнегреческого имени Екатерина — «чистая»
КираЖенская форма от Кир, происходящее от древне-персидского khur — «солнце» либо от древнегреческого кюриос — «повелительница», «госпожа», «владыка» либо от кюрос — «власть», «сила», «право»
КириллОт древнегреческого имени Кюриллос, происходящее от слова кюриос — «владыка, повелитель, господин, Господь»
в переводе с персидского языка — «солнце»
КириллаЖенская форма от Кирилл, происходящего от древнегреческого — «госпожа»
КлавдияЖенская форма от Клавдий, происходящего от римского родового имени Claudius (от латинского claudus) — «хромать»
КлараОт латинского clarus — «светлая», «ясная»
КлимКраткая форма имени Климент, которое произошло от римского родового имени Clemens — «гуманный», «милосердный», «мягкий»
Климент«Милостивый, кроткий, мягкий». Имя древнееврейское.
Кондрат«Широкоплечий», «четырехугольный».
КонстантинОт латинского слова constans — «постоянный», «стойкий»
КорнилийПереводится с латинского языка как «рог».
КристианОт средневекового латинского имени Christianus — «христианин»
КристинаЖенская производная форма от Христиан, происходящего от латинского имени Christianus — «христианка»
КсенияЧужестранка, гостья, гостеприимная
КузьмаОт греческого имени Космас — «кузнец»
ЛаврентийОт римского родового имени Laurentius — «лаврентский, житель города Лаврент»
ЛадаОт древнерусского лада — «любимая», «милая»
ЛарисаОт названия греческого города Лариса/Ларисса
от древнегреческого слова ларос — «сладкая», «приятная»
от латинского слова larus — «чайка», «крепость»
от латинского слова laris — «дух-хранитель»
ЛаураОт названия дерева лавр, в переводе с латинского языка — «увенчанная лавром», в переносном смысле — «победительница»
ЛевВ переводе с греческого — «лев», «царь зверей»
от латинского слова leo — «лев»
ЛейлаВ переводе с арабского языка — «ночь», «темнота»
ЛеонВ переводе с греческого — «лев»
от латинского слова leo — «лев»
ЛеонардОт древнегерманского leo — «лев» и hart, hard — «отважный, стойкий, твердый», т.е. «храбрый лев»
ЛеонидОт древнегреческого имени Леонидас — «подобный льву», «потомок льва», «сын льва»
ЛеониллаВ переводе с древнегреческого — «дочь льва»
ЛеонтийОт древнегреческого имени Леонтиос, происходящее от леонтейос — «львиный»
ЛианаОт названия растения lilium, в переводе с латинского языка — «тонкая», «стройная как растение лиана», «молодая»
от французского имени Элейн (вариант имени Елена) -«сплетенная», «яркая», «ясная», «блестящая», «светлая», «шустрая»
ЛидияОт древнегреческого имени Людиа, происходящего от названия области в Малой Азии — Лидия
в переводе с итальянского — «музыкальная»
ЛилианаОт латинского lilium — «лилия»
от французского имени Лилиан, которое является производной от имени Элизабет (русский вариант — Елизавета)
в переводе с древнегреческого — «цветущая»
ЛилияОт латинского lilium — «лилия»
форма имени Лилит, в переводе с иврита — «ночная», «ночная тишь»
латинизированная форма библейского имени Сосанна (Сусанна) — белая лилия»
вариант имени Лейла (Лейли), в переводе с арабского языка — «темнота», «ночь»
ЛинаОт древнегреческого имени Линос (Лин) — «лён»
в переводе с древнегреческого языка — «печальная весть»
в переводе с латинского языка — «сирена»
ЛиндаОт немецкого lind — «кроткая», «мягкая»
в переводе с испанского языка — «красивая»
ЛияОт древнееврейского имени Леа — «изнуренная», «усталая»
ЛолитаВ переводе с испанского языка — «скорбь», «печаль»
от римского родового имени Lollii — «полевая трава»
ЛуизаОт французского имени Louise (Луиз, Луиза) — женской формы от Louis (Луи), происходящей от древнегерманского имени Chlodovech (Hludowig, Ludewig): (h)lut, hlud — «громкий», «славный», «известный» + wic, wig — «война»
в переводе с древнееврейского языка — «Бог помог»
от имени бога света Луг (Лудж, Лью) — «светлая», «сияющая»
ЛукаОт латинского lux — «свет»
ЛукьянОт личного имени Lucius, происходящее от латинского lux — «свет»
ЛюбовьОт древнегреческого имени Агапе — «любовь»
славянское имя — «любовь»
ЛюдмилаОт общеславянского — «милая людям»
ЛюцияОт римского имени Люций, происходящего от латинского lux — «светлая»
МагдалинаОт имени евангельской Марии Магдалины — «из Магдалы» (так называлось селение на берегу Галилейского озера, где жила Мария Магдалина)
от слова magadella, в переводе с иврита — «завивающая волосы»
МайСо славянского — «теплое сердце»
от имени греческой богини Майи
МайяОт названия месяца мая (лат. Majus)
от имени нимфы Майи, матери греческого бога Гермеса
МакарОт древнегреческого макариос — «благославенный», «блаженный», «счастливый»
МаксимОт римского родового имени Maximus — «величайший»
МаксимилианОт римского родового имени Maximilianus, которое произошло от Maximus — «величайший»
МаликВ переводе с арабского — «царь», «владыка»
МансурВ переводе с арабского — «празднующий победу», «тот, кто одерживает верх»
МаратВ переводе с арабского — «желанный», «желание», «цель»
МаргаритаОт позднелатинского имени Margarita, происходящего от древнегреческого маргаритес — «жемчужина»
МарианнаЖенская форма от Мариан, в переводе с латинского — «морская»
от сочетания древнееврейских имен Мария и Анна — «горькая благодать», «печальная красавица», «возмущение»
от римского родового имени Marianus — «Мариев, принадлежащий Марию», которое имеет корни от родового имени Marius — «принадлежащий богу Марсу»
МаринаЖенская форма от Марин, происходящего от римского родового имени Marinus — «морская»
МарияОт древнееврейского имени Мирьям — «желанная», «горькая», «безмятежная»
МаркОт греческого имени Маркос, происходящее от латинского слова marcus — «молоток»
от французского marquis — «маркиз»
МартаЗападноевропейская форма имени Марфа, произошедшего от древнееврейского имени Марта — «хозяйка», «госпожа», «наставница»
МартинОт римского родового имени Martinus — «посвященный Марсу», «принадлежащий Марсу» (римскому богу войны)
МарфаОт древнееврейского имени Марта — «хозяйка», «госпожа», «наставница»
МарьямВ переводе с арабского — «набожная, служащая Богу»
МатвейОт древнееврейского имени Матфей — «дарованный Богом», «дар Яхве (Бога)», «Божий человек»
МатильдаОт древнегерманского имени Mahthild (Mahthildis,Mathildis): maht — «власть», «сила», «могущество» + hilt, hild — «битва»
МатренаОт латинского matrona — «матрона, почтенная замужняя женщина»
МеланияОт латинского имени Melania, происходящего от древнегреческого имени Мелайна — «черная», «темная»
МиланСо славянского — «милый», «нежный»
МиланаОт славянского корня мил — «милая»
МилицаОт славянского корня мил — «милая»
МиронОт греческого мюрон — «мирра», «миро», «душистая смола», «источающий миро», т.е. «душистая смола миртового дерева (мирта)» или «благоухающий»
таджикская форма персидского имени Миран — «повелитель», «эмир»
МирославСо славянского — «прославленный миролюбием», «прославляющий мир»
МирославаЖенская форма от Мирослав, происходящего от общеславянских «мир» + «слава»
МирраОт древнегреческого имени Мюрра, происходящего от мюрон — «мирра», «миро», «душистая смола»
в переводе с древнееврейского — «миртовое дерево»
МитрофанОт древнегреческого имени Метрофанес: метер — «мать» + файно — «показывать, светить, являть»
МихаилОт древнееврейского имени Михаэль — «равный, подобный Богу», «испрошенный у Бога»
Модест«Скромник». Латинское имя.
МоисейС древнееврейского переводится как «ребенок»; египетский перевод имени Моисей — «из воды взятый». Имя Моисей имеет иудейские корни. Моисей — приемный сын дочери египетского фараона, которая нашла его в корзинке, плывущей по реке.
МоникаОт древнегреческого слова монос — «единственная»
от древнегреческого слова монео — «напоминать», «вдохновлять»
МстиславОт древнерусского мстити — «мстить, отмщать» + «слава», т.е. «славный защитник»
Муза«Женское божество, покровительствующее искусствам, вдохновительница». Имя имеет греческие корни. В древнегреческой мифологии Муза — одна из девяти богинь, покровительниц искусств и науки.
МуратВ переводе с арабского — «желанный», «цель, намерение, желание»
НадеждаОт древнегреческого имени Элпис — «надежда»
НазарОт позднелатинского имени Nazarius — «назаретянин», «тот, кто родом из Назарета»
в переводе с иврита — «посвятивший себя Господу», «обет (обещанное)»
в переводе с арабского языка — «взгляд», «дальновидный», «смотрящий на вещи с хорошей стороны»
НаильВ переводе с арабского — «добивающийся», «достигающий успеха», «приобретающий», «достойный подарка», «польза»
НатальяОт латинского Natalis Domini — «рождение», «Рождество», «рождественская», «родная»
НатанСокращенная форма библейского имени Натанаэль — «Данный Богом»
Наум«Утешающий». Древнееврейское имя. В Библии Наум — древнееврейский пророк, предсказавший гибель Ниневии.
НеллиОт английского имени Nelly — краткой формы от Eleanor (Элинор), Ellen (Эллен) и Helen (Хелен)
от греческого слова неос — «молодая», «новая»
НеонилаОт латинского имени Neonilla, происходящего от древнегреческого мужского имени Неон (от неос) — «молодая», «новая», «юная», «свежая»
НесторОт древнегреческого имени Нестор, происходящее от ностео — «возвращаться, отправляться, благополучно уходить»
НикаОт имени древнегреческой богини победы Ники — «победа»
Никанор«Великий полководец», «увидевший победы». Имя Никанор восходит к византийским истокам, обозначая стремление к борьбе и прозорливость в ведении военных действий.
НикитаОт древнегреческого имени Никетас, происходящее от никетес — «победитель»
НиколайОт древнегреческого имени Николаос — «победитель народов»
НилОт древнегреческого имени Нейлос, происходящее от названия реки Нил
НинаОт еврейского слова нин — «правнучка»
в переводе с грузинского языка — «юность»
от шумерского нин — «госпожа»
Нисон«Победоносец». Древнееврейское имя.
НоннаОт латинского nona — «девятая» или nonna — «монахиня»
ОксанаОт древнегреческого ксенос или ксениа — «гостеприимная», «гостья», «странница», «чужая», «чужестранка»
ОлегОт древнескандинавского имени Hélgi — «священный, святой»
ОлесяСлавянское имя, от слова лес — «лесная», «девушка из леса», «живущая в лесу»
форма женского имени Александра, в переводе с древнегреческого — «защитница»
краткая форма женских имен Олена (Алена), Елена, Лариса, Алиса
ОльгаОт древнескандинавского имени Hélga — «святая», «священная», «мудрая», «светлая», «ясная», «роковая»
древнеславянское имя, происходящее от имен Вольга, Волх — «солнечная», «хорошая», «значимая», «великая»
Орест«Горец, дикарь». Древнегреческое имя.
ОскарВ переводе с немецкого — «копье бога»
ОстапНародная форма греческого имени Евстафий — «твердый, неизменный, стойкий», «твердостоящий»
от греческого имени Евстахий — «цветущий», «плодородный», «пышно колосящийся»
ОфелияОт древнегреческого ophelos — «помощница», «возвышенная», «величественная»
ПавелОт римского родового имени Paulus — «скромный», малый», «незначительный», «младший»
ПавлинаЖенская форма от Павлин — «маленькая», «скромная»
ПамфилИмя Памфил с греческого языка переводится как «общий друг», «общий любимец», «милый всем».
Парамон«Твердый», «надежный», «верный». Это древнегреческое имя.
ПелагеяОт древнегреческого имени Пелагиа — «морская»
ПетрОт древнегреческого имени Петрос — «камень», «твердый», «надежный»
ПлатонОт древнегреческого имени Платон, происходящее от платюс — «широкий, широкоплечий»
ПолинаОт имени древнегреческого бога солнца Аполлона -«солнечная», «посвященная Аполлону»
от французского имени Pauline (Полин) — женской формы имени Paulin (русский вариант — Павлин) — «маленькая», «скромная»
от французского мужского имени Поль (в русском языке — Павел), в переводе с латинского языка — «маленькая»
ПорфирийИмя Порфирий в переводе с греческого означает «багряный».
ПотапВ переводе с греческого языка — «странник»
в переводе с латинского языка — «овладевший»
ПрасковьяОт древнегреческого имени Параскеве — «ожидание», «приготовление», «канун субботнего праздника (пятница)»
ПрохорОт древнегреческого имени Прохорос, происходящее от прохореуо — «управлять хором», «идти впереди хора (танцующих)»
ПульхерияОт латинского pulchra — «прекрасная», «красивая»
РавильВ переводе с еврейского — «Бог — его друг»
в переводе с татарского языка — «юноша», «странник» или «весеннее солнце»
РадаСлавянское имя — «радость», «веселая»
от двух слов «РАбочая+ДемокрАтия»
РадикОт греческого имени Радий — «солнечный луч»
от английского имени Радиант, образованное от латинского слова «radiante» — «излучающий, лучистый»
форма арабского имени Радиф — «младший»
видоизмененная форма славянских имен, имеющих в корне слово рад — «радостный», «радость», «тот, кому рады»
РадмилаОт общеславянских «радость» + «милая»
РадомирВ переводе со славянского — «радующийся миру», «радость мира»
РаисаОт арабского раис — «начальник», «предводитель»
вариант имени Ираида, в переводе с древнегреческого языка — «героиня», «дочь героя»
РамильВ переводе с арабского языка — «волшебный», «чудесный»
РатмирВ переводе со славянского — «ратующий за мир», «воин мира», «войско мира», «ратник»
РафаилИмя Рафаил переводится с еврейского как «исцеление Божие». Древнееврейское имя. Это имя носит один из семи архангелов — архангел Рафаил, врачеватель.
РафаэльОт древнееврейского имени Рефаэль — «Бог исцелил»
РахильОт древнееврейского имени Рахель — «овца», «ягненок»
РашидВ переводе с арабского языка — «разумный», «идущий правильным путем»
РегинаОт латинского regina — «королева»
РенатОт латинского слова renatus — «возрожденный», «заново рожденный»
РенатаЖенская форма от Ренат, происходящего от позднелатинского имени Renatus — «рожденный заново», «возрожденный»
РиммаОт названия города Рима — «римлянка»
в переводе с древнееврейского языка — «яблоко»
РифатВ переводе с тюркского языка – «высоко стоящий», «высокое положение»
РичардВ переводе с немецкого языка — «лидер, вождь» и «могучий, смелый»
РобертОт древнегерманского имени Hrodebert: (h)ruod, hroth — «слава» + beraht, berht — «светлый», т.е. «неувядающая слава», «блестящий от славы»
РодионОт греческого слова родеос — «розовый»
от греческого слова родион — «житель острова Родос»
русская форма древнегреческого имени Иродион — «герой», «героический»
РозаОт латинского rosa — «роза»
от западноевропейского имени Rosa (Rose), происходящего от древнегерманского имени Hrodhaid: (h)ruod, hroth — «слава» + heit — «состояние», «род», «сословие»
в переводе с греческого языка — «роза», «красный цветок»
РоксанаВ переводе с персидского — «предсказательница»
в переводе с иранского языка — «светлая»
РоланВариант немецкого имени Роланд — «родная земля»
РоманОт латинского romanus — «римский», «из Рима», «римлянин»
Роман«Римский, римлянин». Имя происходит от латинского слова «романус».
РостиславВ переводе с древнерусского — «растущая слава», «тот, чья слава растет»
РусланОт тюркского арслан — «лев»
в переводе со славянского — «русый»
РусланаЖенская форма от Руслан:
от тюркского арслан — «лев»
в переводе со славянского — «русая»
РустамВ переводе с персидского языка — «исполин, великан»
в переводе с таджикского — «мощнотелый»
РуфинаЖенская форма от Руфин, происходящего от римского родового имени Rufus (от латинского rufus) — «рыжая», «золотисто-желтая»
РушанВ переводе с персидского — «светлый», «блестящий», «со светлой душой»
СабинаЖенская форма от Савин (Сабин), происходящего от римского родового имени Sabinus — «сабинянка», «красивая»
от арамейского глагола Saba — «мудрая», «неприхотливая»
СавваОт древнегреческого имени Саббас, происходящее от арамейского саба — «старик, старец, мудрец»
краткая форма древнегреческого имени Саббатиос — «суббота»
СавелийОт латинского Sabellus — «сабельский, сабинский»; в переносном значении — «неприхотливый, простой»
СаломеяОт древнегреческого имени Саломе, формы древнееврейского имени Шломит, происходящего от шалом — «мир»
СамвелАрмянский вариант имени Самуил — «Бог услышал»
СамсонОт древнееврейского имени Шимшон — «солнце»
СамуилСовременный вариант древнееврейского имени Шемуэль (Шмуэль) — «Бог услышал»
СараОт древнееврейского имени Сара — «госпожа», «знатная женщина»
СветланаСлавянское имя — «светлая»
от греческого имени Фотиния — «свет»
СвятославОт древнерусского святый — «святой» + «слава», т.е. «священная слава»
СевастьянОт греческого sebastos — «священный», «высокочтимый»
от латинского Sebastianus — «севастийский, тот, кто родом из Севастии»
СеменОт древнееврейского имени Шимон — «Бог услышал»
СерафимОт позднелатинского имени Seraphinus, происходящее от древнееврейского срафим — «огненный»
СерафимаЖенская форма от Серафим, происходящего от позднелатинского имени Seraphinus (от древнееврейского срафим) — «огненная»
СергейОт римского родового имени Sergius — «знатный», «высокий»
СимонВ переводе с древнееврейского — «Бог услышал»
СимонаЖенская форма от Симон, в переводе с древнееврейского — «услышанная Богом»
СнежанаОт славянского снег — «снежная», «Снегурочка»
СоломонОт древнееврейского имени Шеломо, происходящее от шалом — «мир»
СофияОт древнегреческого имени Софиа — «мудрая», «мудрость», «знание»
Софья«Мудрость». Имя имеет древнегреческие корни.
СпартакВ переводе с греческого языка — «житель Спарты», а также «топчущий», «попирающий»
СтаниславОт славянских слов «становиться» + «слава», т.е. «установивший славу», «ставший славным»
СтаниславаЖенская форма от Станислав, происходящего от славянского «становиться» + «слава»
СтеллаОт латинского слова stellar — «звездная»
СтепанОт древнегреческого имени Стефанос — «венок, венец», «корона»
СтефанияОт греческого имени Стефанос (Стефан, в русской транскрипции – Степан) — «венок», «венец», «корона», «диадема»
Сусанна«Белая лилия». Имя Сусанна — от древнееврейского слова «лилия».
СюзаннаОт древнееврейского имени Шошана — «лилия», «белая лилия»
ТагирОт имени одного из сыновей пророка Мухаммеда — «чистый, непорочный»
в переводе с башкирского, татарского — «птица»
ТаисияОт древнегреческого имени Таис — «посвященная Исиде»
ТамараОт древнееврейского имени Тамар — «смоковница», «финиковая пальма»
ТамилаОт древнерусского глагола томити — «томная», «мучительница»
ТарасРусская форма греческого имени Тарасиос — «бунтовщик», «мятежник», «смутьян», «беспокойный»
от латинского слова taurus — «бык», «вол»
ТатьянаОт греческого татто — «учредительница», «устроительница»
от римского родового имени Tatianus (ж. Tatiana), происходящего от имени легендарного сабинского царя Тита Татия (Titus Tatius)
ТеодорВ переводе с латинского — «дар Божий», «посланник Бога»
Терентий«Утонченный». Это замечательное имя пришло к нам из Византии. Так нередко в Византии называли помощников и младших художников, работавших в мастерских великих мастеров живописи и фрески.
ТигранОт персидского имени — «обладающий силой тигра», «тигр»
в переводе с древнегреческого языка — «вспыльчивый»
ТимофейОт греческого имени Тимотеос — «почитающий Бога»
ТимурОт монгольского темер — «железный»
ТихонВ переводе с греческого языка — «судьба», «случай»
от имени древнегреческой богини удачи Тюхе — «удача», «случайность», «жребий»
ТрофимОт древнегреческого имени Трофимос — «кормилец», «питомец», «воспитанник»
УльянаРусская форма имени Юлия, в переводе с латинского языка — «из рода Юлиев», «кудрявая», «пушистая»
советское имя — в честь Ульянова Владимира Ленина
УстиньяЖенская форма от Иустин, происходящего от римского родового имени Justus (от латинского слова justus) — «справедливая»
ФаддейФаддей переводится как «хвала». Древнееврейское имя.
ФаинаОт древнегреческого имени Фаэйне (Фаини) — «сияющая», «блестящая»
ФаридВ переводе с арабского языка — «непревзойденный», «особенный»
ФаридаВ переводе с арабского языка — «бриллиант», «жемчужина», «ценнейшая», «бесподобной красоты, не имеющая себе равных по красоте»
ФевронияОт греческого имени Феврониа, произошедшего от древнегреческого слова «фойбос» — «ясная», «светлая», «лучезарная» или от латинского «faber» — «ремесленник»
ФедорСовременная форма греческого имени Теодорос (Теодорос, Феодорос) — «дарованный Богом», «Божий дар»
Федот«Богоданный», «отданный, посвященный богам». Греческое имя, от имени Теодотос (от слов «теос» — Бог, «дотос» — данный). Постепенно имя трансформировалось в Феодот. На Руси со временем имя Феодот несколько видоизменилось, став известным нам и ныне Федотом.
ФеклаОт древнегреческого имени Теоклея: теос — «бог», «божество» + клеос — «слава»
ФеликсОт латинского felix — «счастливый»
ФелицияВ переводе с латинского — «счастливая»
ФилиппОт древнегреческого имени Филиппос — «любящий лошадей»
ФомаОт имени Томас, происходящее от древнееврейского теом — «близнец»
ФотинияЖенская форма от Фотин, происходящего от древнегреческого имени Фотинос (от фос) — «свет» либо (от фотейнос) — «светлая»
Харита«Прелесть», «милочка». Имя это древнегреческое. В Россию оно пришло уже в период принятия христианства. Древние греки привыкли называть всех Харит богинями радости, любви и красоты. Болгары перевели это имя как Милица. Ныне это имя практически не встречается.
ХаритонОт древнегреческого имени Харитон, происходящее от харис — «красота», «благодать», «радость», «милость»
ЧулпанВ переводе с татарского языка — «утренняя звезда»
ШамильВ переводе с арабского — «всеохватывающий», «всеобъемлющий», «вобравший в себя все положительные качества»
в переводе с тюркского — «легендарный богатырь»
вариант произношения еврейского имени Самуил или от еврейского имени Шимон (Симон, Семен) — «Бог услышал»
ЭвелинаЕврейское имя — «жизненная сила»
от французского женского имени Eveline, производной формы от имени Ева
от английского имени Авелин, происходящего от староеврейского имени Авель — «дыхание»
ЭдгарОт древнеанглийского имени Eadgar — «богатый воин», «удачливый воин»
ЭдуардОт древнеанглийского имени Eadward — «богатый, счастливый» + «войско»
в переводе с немецкого — «страж богатства, достатка, счастья», «священный страж»
ЭлеонораОт древнегреческого слова элеос — «милость», «сострадание»
вариант произношения французского имени Алиенора: ali — «другая», «чужая» + nor — отрицание чего-то, т.е. «нечужая», «своя»
ЭлизаОдна из кратких форм имен Елизавета, Элизабет, Изабелла, в переводе с древнееврейского — «мой Бог — клятва»
в переводе с английского языка — «лебедь»
в переводе с немецкого языка — «благородная дева»
ЭлинаОт греческого слова elli̱niká — «гречанка»
форма древнегреческого имени Елена — «свет», «факел», «светлая», «сияющая»
расшифровывается как «ЭЛектрификация+ИНдустриализация»
ЭллаВ переводе с греческого языка — «свет», «заря»
сокращенный вариант германского имени Alia — «другая»
в переводе с иврита — «богиня», «фисташковое дерево»
ЭльвираОт древнегерманского имени Allovera: ala-wari — «благосклонный», «доброжелательный» либо al — «весь», «все» + war — «верный», «настоящий», «истинный» или war — «бдительный», «осторожный»
в переводе с испанского языка — «оберегающая, защищающая всех»
ЭльдарОт древнескандинавских слов eldr — «огонь» и arr — «воин», т.е. «огненный воин», «воин огня»
форма греческого имени Илиодор (Хелиодорос) — «дар солнца»
форма имени Ильдар, от тюрко-персидских слов ил — «государство» и «дар» — «обладать», т. е. «правитель», «предводитель»
ЭльзаЕвропейская форма имени Елизавета, происходящего от древнееврейского имени Элишеба — «мой Бог — клятва», «почитающая Бога»
ЭльмираВ переводе с татарского языка — «честная», «добросовестная», «знаменитая»
женское парное имя к мужскому имени Эльмир (Эльмер), Эдельмир, Адельмар, Адемар, Альдемар, в переводе с древнегерманского — «славный защитник», «знаменитый воин»
советское революционное имя — от сочетания «ЭЛектрофикация МИРА»
ЭмилияЖенская форма от Эмилий, происходящего от римского родового имени Aemilius (от латинского aemulus) — «соперница»
в переводе с латинского языка — «старательная», «сильная», «крепкая»
вариант греческого имени Эмилиос, происходящего от aimylios — «ласковая», «льстивая»
ЭмильОт римского родового имени Aemilius, которое происходит от латинского слова aemulus — «соперник», «неуступчивый», «ревностный, страстный»
в переводе с персидского — «противник»
ЭммаКраткая форма древнегерманских имен, начинающихся c Erm-(irmin-/erman-/ermun- — «огромная», «всеобъемлющая»
от еврейского мужского имени Эммануэль — «Бог с нами»
в переводе с латинского языка — «драгоценная», «душевная»
в переводе с арабского языка — «верная», «надежная», «спокойная»
ЭммануилОт древнееврейского имени Иммануэль — «с нами Бог»
ЭрастОт древнегреческого имени Эрастос, происходящее от эрастос — «любимый, любезный»
ЭрикОт скандинавского имени Eirikr, состоящего из двух частей «вечный» и «король, правитель», т.е. «вечный правитель»
от германского имени Euric: ewa, ewe — «вечность; обычай, закон» и rihhi, riki — «богатый, могущественный; вождь, правитель»
ЭрикаЖенская форма от Эрик:
от скандинавских корней ei — «постоянный» + rikr — «правитель», т.е. «вечный правитель»
от немецких слов ere — «честь» + rik — «богатство», «могущество», т.е. «обладающий благородством», «благородный богач»
ЭрнестОт древнегерманского имени Ernust (Ernest, Ernst) — «серьезность, старание, усердие»
ЭсмеральдаВ переводе с испанского языка — «изумруд»
ЮлианОт древнегреческого иулос — «пушистый, кудрявый»
в переводе с латинского — «из рода Юлиев», «июльский»
ЮлианаЖенская форма от Юлиан, происходящего от родового имени Julius (от древнегреческого иулос) — «пушистая», «кудрявая»
ЮлийОт древнегреческого иулос — «пушистый, кудрявый»
в переводе с латинского — «из рода Юлиев», «июльский»
ЮлияВ переводе с латинского — «из рода Юлиев», «июльская»
от древнегреческого иулос — «кудрявая», «пушистая»
ЮнаОт римского родового имени Juvenalis — «юная»
от имени древнеримской богини материнства, брака и рождения Юноны – «молодая»
ЮнонаВ переводе с латинского языка — «молодая»
ЮрийОт древнегреческого имени Георгиос, происходящее от георгос — «земледелец», «возделывающий землю»
ЮстинаЖенская форма от Иустин, происходящего от римского родового имени Justus (от латинского justus) — «справедливая»
ЯдвигаОт древнегерманского имени Hedwig: hadu — «борьба», «раздор» + wig — «война», т.е. «воительница»
ЯковОт древнееврейского имени Яакоб — «держащийся за пятку»
ЯнПольская, белорусская и древнерусская формы древнееврейского имени Йоханан — «Яхве милостив»
ЯнаЖенская форма от Ян, происходящего от древнееврейского имени Иоанн — «милость Божья»
от имени римского бога начал и проходов Януса -«дверь», «начало»
ЯромирОбразовано от славянских слов ярый + мир — «солнечный мир»
ЯрополкОт древнерусских яръ — «ярый, буйный, сильный, мощный» + полкъ, пълкъ — «войско, военный поход»
ЯрославОт древнерусского яръ — «ярый, буйный, сильный, мощный» + «слава»
ЯрославаЖенская форма от Ярослав, происходящего от древнерусского яръ — «сильная», «мощная», «яркая», «светлая» + «слава», т.е. «обладающая яркой славой», «славная жизненной силой»

Красивые мусульманские имена для девочек : Мусульманские имена

Многие мусульманские родители задаются вопросом, как назвать своих детей, чтобы имя было красивым, подходящим, приятным на слух, — одним словом, чтобы в наречении им содержался бы «ихсан» — благодеяние по отношению к детям, которые являются аманатом, дарованным Аллахом, и который родители должны особенно тщательно беречь и охранять.

Если имена мальчиков могут быть любыми – и грубыми, и не особо красивыми, то от имен девочек требуется другое – женственность, нежность и красота, чтобы ее будущий муж наслаждался не только ее женственным характером, поведением, одеждой, украшениями, но и приятным, ласкающим слух, именем.

В доисламскую эпоху не все арабы любили своих детей, особенно дочерей, и их отношение к ним часто выражалось в том, как они их называли. Одних могли называть Багида – «ненавистная, презренная», а других – Джусама, «ночной кошмар».

С приходом ислама на просторах мусульманских земель распространились имена любимых и уважаемых для каждого мусульманина женщин: Марьям, Асия, Фатима, Хадиджа, Аиша, Зайнаб и другие имена сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم и прославленных в исламе женщин. Причиной же распространения имен, не имеющих исторической важности, стало их красивое звучание. И какими бы достоинствами не обладали в свое время женщины по имени Даъд, Тумадыр или Фурейъа, для многих мусульман более привлекательными казались непрославленные никем важным имена – Фарида, Фарах, Малика и т.д., ведь важно не то, кто носил имя, а то, как оно звучит в современном обществе, как к нему относятся окружающие, и, конечно, чтобы оно нравилось тому, кто называет ребенка, — как правило, отцу.

Среди самых популярных женских имен в арабском мире, которыми называли несколько десятилетий назад, можно назвать Амаль, Мона, Маналь, Ханан, Иман – мягко звучащие имена. В наши дни мода кардинально изменилась, и, как следствие, среди самых частых имен в Иордании, Саудии, Египте и некоторых других арабских странах, можно увидеть такие имена, как Ляян, Шахд, Джана, Разан и т.д. (см. официальную статистику по Иордании за прошлый год).

Конечно, не все родители, называя своих дочерей, преследуют целью подобрать для них красивое имя. Для многих из них гораздо важнее то, что это имя относится к исламской истории (см. Имена сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم) или что это имя их матери или других родственников или знакомых женского пола. Некоторые стремятся назвать дочерей строго, солидно, без намека на привлекательность и женственность. И, конечно, личный вкус всегда отличается у разных людей, и красота, в том числе имени, — вещь относительная.

Понятно, что то, что красиво для арабов, может не подойти неарабским народам. В любом случае хорошо, если мусульманское имя для девочки будет женственным, нежным и приятным для всех.

Ниже приводятся некоторые арабские имена, которые имеют приятное произношение и звучание. Большинство из них красиво и уместно смотрятся в арабских странах в наши дни среди молодого поколения мусульманок.

А

1.      Имя Аиша عائشة достигло большого распространения по всему исламскому миру, за исключением шиитских областей. Помимо любимой жены пророка صلى الله عليه وسلم это имя принадлежало всего восьмерым сподвижницам:

Аише бинт Джарир бин Амр аль-Ансарии, Аише бинт Аби Суфьян бин аль-Харис аль-Ансарии, Аише бинт Шейбе бин Рабиа, Аише бинт Абдуррахман ан-Надрие, Аише бинт Умейр бин аль-Харис аль-Ансарие, Аише бинт Къудама аль-Джумахие, Аише бинт Муавии бин аль-Мугире (матери халифа Абдулмалика бин Марвана) и Аише бинт Саъд бин Аби Ваккас. По сравнению с другими именами (Зейнаб, Хинд, Фатима, Лейла и пр.) это немного. Но с распространением ислама это имя заняло лидирующие позиции среди женских имен мусульманок, и случилось это, по всей видимости, не только из-за высокого положения, занимаемого Аишей бинт Аби Бакр رضي الله عنهما в сердцах мусульман, но и из-за красивого, приятного звучания этого имени.

От корня عيش – «айн-я-шин», означающего «жизнь», образовываются и другие имена – Айяш عياش («живущий; долго живущий»), Яиш يعيش  («живет, будет жить») и Аиш عائش  («живущий»). В наше время эти имена почти не употребляются.

В разных странах это имя произносят и пишут по-разному: Айшат, Айша, Айше, Айшату и т.д. Правильным является его произношение с ударением на первый слог и удлинением алифа, идущего после «айн» — عــــائــشـــة Аиша.

2.      Алия عالية, «высокая, возвышенная, выдающаяся, высотная». Имя произносится с ударением на первый слог.

Одну из сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم звали аль-Алия бинт Забьян бин Амр бин Ауф бин Абд бин Аби Бакр аль-Килябия. Имя Алия علية, с ударением на второй слог, распространено меньше.

Алия бинт аль-Хусейн – иорданская принцесса, дочь короля аль-Хусейна бин Таляля от его первой жены Дины бинт Абдулхамид. В 1977 году она вышла замуж за Насера Васфи Мирзу и родила ему сына Хусейна. После развода с Мирзой она вышла замуж за Мухаммада ас-Салеха в 1988 и родила Таляля и Абдулхамида.

Принцесса Алия ат-Табаъ – жена Фейсала бин аль-Хусейна, сына предыдущего иорданского короля аль-Хусейна бин Таляля, родного брата нынешнего иорданского короля Абдуллы бин аль-Хусейна. Алия родила ему сына Умара и трех дочерей – Аю, Аишу и Сару. В 2008 году Фейсал с ней развелся.

3.      Амани أماني , «желания, мечты» (ударение на второй слог). Это частое имя для многих арабских стран, хотя его популярность сейчас идет на спад. Оно также является одним из часто используемых арабских имен в Америке (в 2009 году заняло 579-ое место среди женских имен).

4.      Амира أميرة , «принцесса, эмирка, княжна». Хотя женщина, названная Амирой, может быть простолюдинкой (как правило, настоящие амиры никогда этим именем не зовутся), в наречении этим именем может быть надежда на то, что обладательница этого имени будет «амирой» в переносном смысле, например, амирой по своему нраву, характеру, амирой среди других женщин ее круга и т.д.

5.      Амина أمينة , «верная, надежная, честная, благополучная; доверенная». Это одно из самых популярных женских мусульманских имен на уровне всей мусульманской уммы. Несмотря на то, что оно почти не использовалось арабами до ислама, с распространением истинной религии это имя завоевало лидирующие позиции во многих странах.

Во времена пророка обычно называли Амина آمنة – с ударением на первый слог и значением «находящаяся в безопасности, мирная; безопасная». Так звали мать пророка صلى الله عليه وسلم, одну из самых благородных женщин племени къурайш своего времени.

Для некоторых неарабских народов красивее и удобнее показалось сделать ударение не на первый, а на второй слог, и так ничем не примечательное имя Амина أمينة стало частым и любимым для многих людей. В наше время в большинстве арабских стран это имя используется редко и считается устаревшим, но это не умаляет его достоинств и не делает его хуже.

6.      Аниса أنيسة – «дружелюбная, ласковая, приветливая, подруга, собеседница» (ударение на второй слог. С ударением на первый слог слово будет значить «девушка» (незамужняя). Имя нескольких сподвижниц, распространившееся по многим неарабским странам. Даже в кафирских странах его можно встретить достаточно часто – в статистику США (1000 самых частых имен) оно впервые попало еще в 1967 г.

Имя «Аниса» часто встречается в древних исторических книгах. Аниса бинт Саълаба аль-Ансария была сподвижницей. Аниса бинт Аби Хабиба аль-Ансария принесла присягу пророку صلى الله عليه وسلم. Среди других сподвижниц можно упомянуть Анису бинт Хубейб аль-Ансарию, которая передавала хадисы от пророка صلى الله عليه وسلم; Анису бинт Рафеъ аль-Ансарию (принесла присягу пророку صلى الله عليه وسلم), Анису бинт Ругм аль-Ансарию, Анису бинт Саиду из бану Амр бин Ауф, Анису бинт Аби Тальха аль-Ансарию, Анису бинт Абдиллях аль-Ансарию, Анису бинт Ади аль-Ансарию, Анису бинт Ади аль-Къурашию, Анису бинт Урву аль-Ансарию и многих других. Анисой звали молочную сестру пророка صلى الله عليه وسلم, дочь его кормилицы Халимы ас-Саъдии.

Арабы часто использовали корень «алиф-нун-син» в своих именах. Однокоренные к Анисе имена – Унс أُنس  (женское), Анас أنس , Анис أنيس , Унейс أنيس , Унейса أُنيسة , Инас إيناس, Муънис مؤنس  и Муъниса مؤنسة .

7.      Асия آسية , «утешающая; лечащая» (ударение на первый слог). Имя одной из четырех наиболее совершенных в своей религии женщин – Асии бинт Музахим, жены Фиръауна.

Всевышний Аллах сказал:

وَضَرَبَ اللَّهُ مَثَلا لِّلَّذِينَ آمَنُوا اِمْرَأَةَ فِرْعَوْنَ إِذْ قَالَتْ رَبِّ ابْنِ لِى عِندَكَ بَيْتًا فِى الْجَنَّةِ وَنَجِّنِى مِن فِرْعَوْنَ وَعَمَلِهِ وَنَجِّنِى مِنَ الْقَوْمِ الظَّالِمِينَ

«Аллах привел в качестве примера о верующих жену Фараона. Вот она сказала: «Господи! Спаси меня от Фараона и его деяний! Возведи для меня дом в Раю возле Тебя и спаси меня от несправедливых людей!»

(сура «ат-Тахрим», 11).

Пророк صلى الله عليه وسلم сказал:

« أَفْضَلُ نِسَاءِ أَهْلِ الْجَنَّةِ خَدِيجَةُ بِنْتُ خُوَيْلِدٍ وَفَاطِمَةُ بِنْتُ مُحَمَّدٍ وَآسِيَةُ بِنْتُ مُزَاحِمٍ امْرَأَةُ فِرْعَوْنَ وَمَرْيَمُ ابْنَةُ عِمْرَانَ »

«Лучшие женщины в Раю — Хадиджа бинт Хувейлид, Фатима бинт Мухаммад, Асия бинт Музахим, жена Фараона, и Марьям, дочь Имрана» (хадис привел имам Ахмад, № 2720).

Часто это имя пишут с «алифом» в конце –

آسيا, и тогда оно выглядит так же, как название материка Азия.

Среди кафирских народов есть похожие имена – Ася у славян и Asia на западе, где так обычно называют, связывая это имя с Азией.

Д

8.      Дана دانة (ударение на первый слог), «большая, крупная жемчужина». Это современное арабское имя имеет аналоги в других языках – похожее имя используется у евреев, славян, немцев, англичан и т.д. У арабов можно встретить это имя с определенным артиклем – ад-Дана الدانة. Иногда вместо «та марбуты» на конце имени пишут на западный манер «алиф» — دانا. В Иордании в 2009 году это имя оказалось на 44-ом месте.

9.      Дарин دارين (ударение на последний слог) – арабское имя, употребляющееся уже довольно давно. Как многие другие имена (Макка, Бейсан, Джуди, Тейма, Фурат, Дияля и т.д.), оно возникло по названию географического объекта. Дарином назывался портовой город (и прилегающая к нему территория) в Бахрейне, куда привозили миски (мускус) в основном с Индии.

Похожие имена есть и у некоторых других народов, кафирских: Дарин – мужская форма имени Дарина у некоторых славянских народов. Кроме того, это мужское имя у англичан (с ударением на первый слог).

Сразу можно оговориться, зачем здесь приводятся иностранные статистики, значения неарабских, но созвучных с арабскими, имен и т.д. – для расширения кругозора. Чтобы не казалось удивительным, что кто-то в Латинской Америке, будучи католиком, называет Ясмин, Джамиля и Фатима, что в число наиболее частых имен в Бельгии входят арабские имена Нур, Рания, Ясмин и Сальма, а имена Майя, Мира и Дана встречаются более чем в трех культурах.

Однако такие мультикультурные имена могут таить в себе опасность: некоторые мусульмане могут специально выбирать их из любви к кафирской культуре. С таким намерением (подражать кафирам) подобными имена называть не положено.

По этому поводу можно привести фатву:

«Разрешены ли или запрещены имена Дания и Лина? И джазакумуллагу хайран.

Ответ: хвала Аллаху, и да пребудет мир и благословение над посланником Аллаха, над его семьей и сподвижниками, а затем:

Если значения этих двух имен берутся из арабского языка, то значение первого из них (Дания) – от слова «близость», т.е. «близкая». Значение второго имени берется от слова «нежность», и «лина» означает пальму или особый вид пальм. Явно, что нет запрета на два эти имени, и они никак не противоречат шариату.

Если же они взяты из иностранных имен, то мы не знаем их значения, и, следовательно, мы не можем сказать о дозволенности называть ими при отсутствии знания значений. Вместе с этим, существует столько ясных арабских имен, что нет нужды называть чем-то неизвестным.

И Аллах знает лучше».

В арабском языке слово «дарин» также является множественном числом от слова «дари دارِ » — «знающий, сведующий».

10. Джамиля جميلة , «красивая». Это древнее арабское имя, про которое можно точно сказать, что оно нравилось пророку صلى الله عليه وسلم. Если бы это было не так, он бы не стал переименовывать женщину, которую звали Асыя عاصية («непокорная»), и называть ее Джамилей. Ибн Аби Шейба привел от аль-Хасана бин Мусы от Хаммада, от Убейдуллы бин Умара, от Нафеъ, от Ибн Умара, что дочь Умара звали Асыя, и посланник Аллаха صلى الله عليه وسلم назвал ее Джамилей. Также говорили, что Асыей звали не дочь, а жену Умара бин аль-Хаттаба رضي الله عنه – Джамилю бинт Сабит бин Абиль-Афлях.

Было несколько других сподвижниц с таким же именем – Джамиля бинт Убей аль-Хазраджия, Джамиля бинт Аус аль-Муррия, Джамиля бинт Саъд бин ар-Рабиъ аль-Ансари и другие.

Позднее это же имя получило несколько известных в истории ученых и мухаддис.

Оценили это имя и неарабские народы – оно часто используется в различных мусульманских странах Азии и Африки. Даже в США, где процент мусульман очень низкий, это имя заняло 468-ое место в 1977 году, а в Латинской Америке используется форма этого имени — Yamila.

В арабском мире это имя тоже употреблялось, но последнее время им называют редко.

11.  Джана جنى (ударение на первый слог) – одно из современных арабских имен, пользующихся большой популярностью (например, в Иордании в 2009-ом году оно заняло второе место). Даже в Египте, где вместо «джим» традиционно говорится «гим», это имя обычно произносят правильно (Джана, а не Гана).

Значение этого имени – «свежие плоды», и это одно из слов, упомянутых в Коране. Всевышний Аллах сказал:

وَلِمَنْ خَافَ مَقَامَ رَبِّهِ جَنَّتَانِ

فَبِأَيِّ آلاءِ رَبِّكُمَا تُكَذِّبَانِ

ذَوَاتَا أَفْنَانٍ

فَبِأَيِّ آلاءِ رَبِّكُمَا تُكَذِّبَانِ

فِيهِمَا عَيْنَانِ تَجْرِيَانِ

فَبِأَيِّ آلاءِ رَبِّكُمَا تُكَذِّبَانِ

فِيهِمَا مِنْ كُلِّ فَاكِهَةٍ زَوْجَانِ

فَبِأَيِّ آلاءِ رَبِّكُمَا تُكَذِّبَانِ

مُتَّكِئِينَ عَلَى فُرُشٍ بَطَائِنُهَا مِنْ إِسْتَبْرَقٍ وَجَنَى الْجَنَّتَيْنِ دَانٍ

«Тем же, которые боялись предстать перед своим Господом, уготовано два сада.

Какую же из милостей вашего Господа вы считаете ложью?

В них обоих есть ветви.

Какую же из милостей вашего Господа вы считаете ложью?

В них обоих текут два источника.

Какую же из милостей вашего Господа вы считаете ложью?

В них обоих есть от всех фруктов по паре.

Какую же из милостей вашего Господа вы считаете ложью?

Они будут лежать, прислонившись, на матрацах, выстланных снизу парчой, а свежие плоды этих двух садов будут склоняться низко» (сура «ар-Рахман», 46-54).

12.  Джуди جودي (ударение на первый слог) – название горы, на которой остановился ковчег (сафина) пророка Нуха عليه السلام. Об этом упоминается в Коране:

وَقِيلَ يَا أَرْضُ ابْلَعِي مَاءَكِ وَيَا سَمَاءُ أَقْلِعِي وَغِيضَ الْمَاءُ وَقُضِيَ الأَمْرُ وَاسْتَوَتْ عَلَى الْجُودِيِّ وَقِيلَ بُعْدًا لِلْقَوْمِ الظَّالِمِينَ

«И было сказано: «О земля, поглоти свою воду! О небо, перестань!» Вода спала, и свершилось веление. Ковчег пристал к аль-Джуди, и было сказано: «Да сгинут люди несправедливые!» (сура «Худ», 44).

Есть разногласия по поводу того, где находится аль-Джуди, и одно из мнений – что это гора в Ираке, рядом с г. Мосул.

Можно заметить, что это имя напоминает английское женское имя Judy, являющееся уменьшительной формой от Judith (по-русски – Юдифь). Но вряд ли арабы подражают с этим именем западу – в США имя Джуди перестало входить в «1000 самых популярных имен» уже в 1998 г., до этого тоже было непопулярно, и пик его распространенности приходился на 1944 год, когда оно заняло 12-ое место в американской статистике. Другие варианты его записи – Judie, Judi, Jody, Jodie и Jodi также не пользуются никакой популярностью последние 10-15 лет, равно как и Judith, занявшая в 2009 году 769-ое место в США и 2021-ое – в Англии.

В арабском языке есть похожее, но неоднокоренное к Джуди имя – Джуд جود, означающее «щедрость, великодушие» и использующееся в некоторых местах чаще, чем Джуди.

13.  Джумана جمانة (ударение на второй слог) – «жемчужина».

Джумана бинт Аби Талиб была родной сестрой Али бин Аби Талиба رضي الله عنه. Она была матерью Абдуллы и Джаъфара, сыновей Аби Суфьяна бин аль-Хариса бин Абдулмутталиба.

Джумана бинт аль-Хасан была женой известного сподвижника Хузейфы бин аль-Ямана رضي الله عنهما.

Наша современница Джумана бинт Мухаммад бин Абдуррахман аль-Арифи – дочь известного саудийского даъватчика.

14.  Джури جوري (ударение на первый слог) – одно из сравнительно новых арабских имен. Оно означает одну из наиболее красивых разновидностей роз. По-русски «вард аль-джури» («розы аль-джури») называют дамасскими розами.

Часто можно встретить это имя с определенным артиклем «алиф-ляф» — Аль-Джури الجوري .

Так, например, аль-Джури зовут дочь одного из имамов Запретной мечети (аль-масджид аль-харам) Сауда бин Ибрагима аш-Шурейма.

З

15.  Загра (Захра) زهرة (ударение на первый слог), «цветок; красота; лучшая пора; блеск». Аллах сказал в Коране:

وَلا تَمُدَّنَّ عَيْنَيْكَ إِلَى مَا مَتَّعْنَا بِهِ أَزْوَاجًا مِنْهُمْ زَهْرَةَ الْحَيَاةِ الدُّنْيَا لِنَفْتِنَهُمْ فِيهِ وَرِزْقُ رَبِّكَ خَيْرٌ وَأَبْقَى

«Не заглядывайся на то, чем Мы наделили некоторых из них (неверующих), чтобы подвергнуть их этим искушению. Это – блеск земной жизни, а удел твоего Господа лучше и долговечнее» (сура «Таха», 131).

16.  Загра (Захра) زهراء (ударение на последний слог), «блестящая, яркая, светлая». Таким был один из эпитетов любимой из дочерей пророка صلى الله عليه وسلم Фатимы Умм аль-Хасан.

К

17.  Карима كريمة , «щедрая, благородная; дочь». Это древнее арабское имя редко когда включалось в категорию самых частых имен. Каримами звали дочь сподвижника аль-Микъдада бин аль-Асвада, а также многих мухаддис и ученых. Одной из самых известных из них была Карима бинт Ахмад бин Мухаммад аль-Марвазия, Уммуль-Кирам. Она прославилась своим умом и проницательностью, жила около 100 лет и умерла в Мекке в 463 году по хиджре.

Л

18.  Лейла ليلى . Список «красивых» имен был бы не полным без имени Лейла, которое нравится не только многим мусульманам, но и некоторым кафирам. Так, согласно статистике США, имя Leila в 2008 году заняло 226-ое место среди женских имен (в Англии – 158-ое), а Layla – 45-ое (в Англии – 68-ое).

Почти во всех неарабоязычных интернет-ресурсах приводится, что значение этого имени – «ночь», иногда пишут, что это «ночная красота» и «родившаяся ночью».

В арабском языке это слово имеет много значений, упомянем некоторые из них:

  • Словосочетание «лейлятун лейля» — ليلة ليلاء أو ليلة ليلى – «самая темная ночь месяца». Т.е. «Лейла» — не просто ночь, любая (тогда бы имя писалось по-арабски как ليلة), а длинная, темная, тяжелая беспросветная ночь.
  • Опьянение, или, говоря точнее, начало охмеления.
  • Название местности.
  • Одно из названий вина (как и словосочетание Умм Лейла أم ليلى  – «мать Лейлы»).

Говоря о положительных качествах этого имени, следует сказать, что его носило несколько сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم, и ни одной из них он не посоветовал сменить имя, одно из значений которого – «опьянение», среди них была Лейла бинт аль-Джуди бин Ади бин Амр аль-Гассани, жена Абдуррахмана бин Абу Бакра ас-Сыддикъа, Лейла бинт Хабис ат-Тамимия, сестра известного сподвижника аль-Акъраъ бин Хабиса и другие.

19.  Имя Лин لين обозначает «нежность, мягкость, кротость». Оно является одним из современных арабских имен, и раньше так почти не называли. Среди рожденных в 2009 году девочек в Иордании имя заняло 11-ое место по распространенности.

20.  Лина لينة (ударение на первый слог). В отличие от Лин, это очень старое арабское имя. Об этом может говорить тот факт, что так называли еще во времена пророка صلى الله عليه وسلم. Линой звали женщину, которая владела местом под названием «Къуба». В том месте она привязывала своих ослов. Саъд бин Хейсама построил там мечеть, но люди из мечети ад-Дырар сказали: «Мы будем молиться в месте, где привязывались ослы Лины? Нет, мы построим свою мечеть и будем делать намаз в ней». И Всевышний Аллах ниспослал аят:

وَالَّذِينَ اتَّخَذُوا مَسْجِدًا ضِرَارًا وَكُفْرًا وَتَفْرِيقًا بَيْنَ الْمُؤْمِنِينَ وَإِرْصَادًا لِمَنْ حَارَبَ اللَّهَ وَرَسُولَهُ مِنْ قَبْلُ وَلَيَحْلِفُنَّ إِنْ أَرَدْنَا إِلا الْحُسْنَى وَاللَّهُ يَشْهَدُ إِنَّهُمْ لَكَاذِبُونَ

«Те, которые построили мечеть для нанесения вреда, поддержания неверия, внесения раскола в ряды мусульман и создания заставы для тех, кто издавна сражается против Аллаха и Его Посланника, непременно будут клясться: «Мы не хотели ничего, кроме добра». Аллах свидетельствует, что они являются лжецами» (сура «ат-Тавба», 107).

Хотя правильным является написание имени через «та марбуту» — لينة – часто можно встретить, что арабы записывают это имя через «алиф» — لينا.

Значение имени – «пальма» (а не «нежная», как можно встретить в некоторых интернет-ресурсах. Слово «нежная» произносится «Леййина» ليّنة). Аллах сказал:

مَا قَطَعْتُمْ مِنْ لِينَةٍ أَوْ تَرَكْتُمُوهَا قَائِمَةً عَلَى أُصُولِهَا فَبِإِذْنِ اللَّهِ وَلِيُخْزِيَ الْفَاسِقِينَ

«Срубили ли вы пальмы или оставили их стоять на их стволах – на то было соизволение Аллаха, дабы опозорить нечестивцев» (сура «аль-Хашр», 5).

Имя Лина очень интернационально: оно используется англоязычными народами, итальянцами, скандинавами, литовцами, французами, испанцами, португальцами, украинцами, белорусами, датчанами, шведами и др. (отдельно и в качестве сокращений от имен, заканчивающихся на –лина).

21.  Люджейн لجين (ударение на последний слог) – «серебро». В 2009 году в Иордании это имя заняло 13-ое место по популярности.

22.  Лямис لميس (ударение на последний слог), «мягкая, нежная, приятная на ощупь». Таким предположительно было имя одной из сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم – Лямис бинт Амр бин Харам (другой вариант, пришедший из рукописей – что ее звали Лябис).

В историю также вошла певица-рабыня-Лямис, жившая в эпоху Аббасидов.

Долгое время это имя находилось в забытьи, но последние несколько лет оно ожило вновь. В иорданской статистике оно занимает 38-ую строку среди женских имен, а в других странах, как, например, Саудия, в некоторых регионах употребляется еще чаще.

23.  Ляян (Лаян, Леян) ليان (ударение на последний слог) – имя, которое в наши дни пользуется наибольшей популярностью в некоторых арабских странах. Так, например, оно заняло пятое место среди имен девочек, рожденных в Иордании в 2009 году.

Свою популярность оно смогло завоевать исключительно своим приятным для арабов звучанием и значением – за всю исламскую историю не было ни одной значимой личности, которую бы так звали.

Что касается значения имени, то Лаян ليان означает «счастливая жизнь», как сказано в словаре «Лисан аль-араб».

«Ляян» — масдар от глагола «ляна-ялин» لان — يلين и значит «мягкость, нежность, гибкость, плавность». Когда говорят, что человек живет в «ляяне», то имеют в виду, что он живет в благоденствии и благополучии.

М

24.  Мэй (Май, Мэйй, Майй) مي . Обычно в интернете это имя проходит с описанием «древнее арабское имя». Оно действительно древнее, т.к. встречается еще в доисламских къасыдах (стихах). Вероятнее всего, что Мэй стало формой имени Майя مية, которым арабы в наше время почти не называют. Те, кому нравится имя Майя, на западный манер, записывают своих дочерей как مايا.

Однако при ближайшем рассмотрении двух этих имен – Май и Майя, становится понятен их смысл. В «Лисан аль-араб» говорится: «Майя – женское имя, и Мэй – тоже. Говорили, что Майя – одно из названий обезьяны, и в честь нее была названа женщина. Аль-Лейс сказал: «Майя – женское имя. Люди считали, что самка обезьяны называется «майя» или «манна». Ибн Барри сказал: «Аль-Майя – обезьяна, как передается от Ибн Халвейха. Что касается слова Мэй, то это стихотворная форма имени».

Таким образом, Мэй, как и Мэйя, обозначает у арабов «самка обезьяны». Впрочем, древние арабы любили называть своих детей названиями животных – Кальб («собака»), Кулейб («собачка»), Джахш («осел»), Саъляба («лиса») и т.д., и обезьяна не исключение.

Также считается, что Мэй – одно из названий вина, и третье его значение – «прислуга, рабыня».

Неудивительно, что такое простое и короткое имя имеет аналоги в других культурах. May – это английское имя, образованное от название месяца мая, который в свою очередь происходит от имени Μαια – одной из древнеримских «богинь». Это имя есть у индусов — माया, и это также имя одной из их многочисленных «богинь», а также встречается у евреев. Иногда на западе этим именем называют в честь индейцев-майя. Имя Май действительно интернациональное, т.к. есть еще у вьетнамцев и японцев.

В любом случае, нельзя сказать, что это имя по исламу нежелательно только потому, что у кого-то была «богиня» с таким именем, — оно по праву может считаться арабским, и на него нет запрета. Единственное, что может оттолкнуть того, кто хочет назвать свою дочь Мэй – значение («самка обезьяны»).

Оно довольно сильно распространено среди арабов – например, в Ираке, странах Шама и Египте. Имя Майя присутствовало также в ассирийских языках, и его произношение сходно со словом «вода» на диалектах (на фусхе говорится ماء – маъ, а в жизни – «майя» и «мойя» — уменьшительная форма «ма»).

Однако последнее время так называют все меньше и меньше, и, возможно, причина этого в том, что большее количество людей знают о его значениях.

25.  Малика, «королева, царица».

Этим русским написанием можно изобразить 3 разных слова, которые могут быть именами:

Малика مالكة  (ударение на первый слог с удлинением),

Малика ملكة  (удлинений нет, ударение на первый слог) и

Малика مليكة  (ударение на второй слог с удлинением).


Все эти три имени будут иметь похожее значение – «чем-то владеющая, обладающая, правящая».

Среди сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم часто встречалось имя Мулейка مليكة  – уменьшительная форма от «Малика».

Этими именами в наши дни редко называют в большинстве арабских стран, хотя раньше оно использовалось чаще. Среди тех, кого звали этим именем раньше, можно упомянуть Малику бинт Ибрагим бин Абдуррахман ад-Димашкъию – мухаддису восьмого века по хиджре. Малика бинт Дауд бин Мухаммад бин Саид аль-Къуртуки была суфистской ученой-долгожительницей шестого века по хиджре, а Малика бинт Абдулла аль-Макъдисия – мухаддисой восьмого века, как и Малика бинт Абдуррахман бин Мухамад аль-Баъльбакки.

26.  Марьям مريم (ударение на первый слог). Один из способов распознать по-настоящему красивое имя – посмотреть на то, насколько часто и долго оно встречается в обществе. Начиная с первого века по хиджре имя Марьям стало одним из самых популярных женских имен в умме Мухаммада صلى الله عليه وسلم. Много было имен, которые то распространялись, то исчезали через какое-то время, надоев, но имя Марьям всегда оставалось в числе подходящих для любого места и времени имен.

Известно, что Марьям – единственное женское имя, которое упоминается в Коране (остальные упомянутые в Коране женщины не называются прямо – «жена Адама», «жена фараона», «мать Мусы» и т.д.). На иврите оно произносится «Мирьям».

Очевидно, что популярность этого имени связана сразу с несколькими факторами:

  • Это имя одной из лучших женщин  — «Лучшие женщины в Раю — Хадиджа бинт Хувейлид, Фатима бинт Мухаммад, Асия бинт Музахим, жена Фараона, и Марьям, дочь Имрана», и ее имя 33 раза приходит в 11 сурах.
  • Образ Марьям, матери Исы عليه السلام, полон чистоты, богобоязненности и благочестия. Можно сказать, что Марьям – символ женского целомудрия и религиозности. Возвращаясь к этому образу, люди дают своим дочерям это имя в надежде, что она будет чем-то похожа на тезку, противостоя разврату современности.
  • Это всем известное и употребляемое имя. Многие люди называют так в честь своих знакомых или подражая самим знакомым, которые называют так своих дочерей. В некоторых арабских странах, например, в Тунисе, имя Марьям занимает первое место среди имен новорожденных девочек.
  • Фонетически это имя звучит очень привлекательно на многих языках: сочетание букв «мим», «ра», «я» и «мим» придают ему нежность, мягкость и серьезность.

Имя использовалось среди арабов и до ислама. Среди сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم были:

  • Марьям бинт Ияс аль-Ансария. Ее отец и дяди участвовали в битве при Бадре;
  • Марьям бинт Аби Суфьян аль-Ансария ад-Даусия из бану Амр бин Ауф. Ее отец пал шахидом в битве при Ухуде.
  • Марьям бинт Осман аль-Ансария.
  • Марьям аль-Магалия, жена Сабита бин Къайса бин Шаммаса.

27.  Мира ميرة (ударение на первый слог) – арабское имя, означающее «провизия, провиант». Оно начало использоваться сравнительно недавно, поэтому распространилось еще не во всех арабских странах.

Похожее имя есть в санскрите и в некоторых славянских языках (как отдельное имя и как сокращение от имен, включающих в себя корень «мир», например, Мирослава, Любомира и т.д.).

28.  Мунира منيرة , «светящаяся, светлая, яркая, блестящая». Несколько десятилетий назад это имя было одним из самых популярных в Саудовской Аравии. Сейчас им называют все реже и реже. Почти у каждого саудовского короля можно найти или жену, или дочь по имени Мунира. У короля-основателя Абдулазиза было две жены с таким именем: амира Мунира бинт Фейсал ар-Рашид, от которой у него не было детей, и амира Мунира, родившая ему Таляля-второго, Наввафа и дочь Мадави. Мунирой звали вторую из 27 дочерей короля, которую родила его вторая жена Вадха бинт Мухаммад аль-Урейъир.

Н

29.  Нармин نرمين (ударение на последний слог), имя неарабского происхождения, означающее «нежная, мягкая» (тур. Nermin).

Арабские имена обогащались иностранными именами – персидскими, тюркскими и курдскими, начиная с древних времен. Некоторые из таких имен, как Ясмин и Джумана, полностью арабизировались, а другие (Нариман, Сафиназ, Шахиназ, Махинур и т.д.) в свое время использовались только в некоторых арабских странах, и сейчас употребляются сравнительно редко. Имя Нармин распространилось не по всему арабскому миру, и на Аравийском полуострове, например, им почти не называют.

30.  Нуджуд نجود , множественное число от «неджд نجد » — «плоскогорье, возвышенность, плато».

31.  Нур نور («свет») – популярное имя во многих арабских странах (в Иордании в 2009-ом году заняло седьмое место) и даже в некоторых европейских (в Бельгии оно находится на сороковом месте в статистике).

Одна из его современных известных носительниц – Нур бинт Наджиб аль-Халяби (урожденная Лиза), одна из жен предыдущего иорданского короля аль-Хусейна и мать хашимитских принцев Хамзы, Хашима, Иман и Раи.

Несмотря на то, что слово «нур» — мужского рода, и оно считается общим для женщин и мужчин, в последнее время так называют почти исключительно девочек.

В предыдущие века обычно называли не просто «Нур», а добавляли к этому слову другие слова, как Нуруль-ислам, Нуруль-гуда и т.д.

Нурджахан звали индийскую королеву, прославившуюся своей щедростью и благотворительностью.

32.  Нура  نورة (ударение на первый слог). Хотя само по себе слово «нура» означает «известняк; средство для удаления волос с тела, сделанное из извести», обычно так называют, имея в виду женскую форму слова «нур», т.е. можно сказать, что имя переводится как «света» или «луч света».

На протяжении долгих лет это имя оставалось одним из наиболее частых в Саудовской Аравии и некоторых других арабских странах.

Нур и Нура – наиболее частые имена от корня «нун-вав-ра». Другие однокоренные имена (Нурия نورية , Нури نوري , Наввар نوار , Наввара نوارة , Анвар أنور , Анвар أنوار , Нуран نوران , Нурания نورانية  и т.д.) используются редко.

Р

33.  Рания رانية (ударение на первый слог), часто пишется через «алиф» в конце — رانيا, «смотрящая пристально, не моргая».

Одна из наиболее известных носительниц этого имени – Рания Фейсал Ясин, жена иорданского короля Абдаллы, мать его детей аль-Хусейна, Хашима, Иман и Сальмы.

34.  Рахма رحمة (ударение на первый слог), «милость, милосердие».

35.  Раяна ريانة (ударение на второй слог). Слово «райяна» является женской формой слова «райян» — «обильно орошенный, напоенный». Более литературная женская форма будет звучать как Райя ريا.

36.  Рима ريمة, чаще всего пишется через «алиф» на конце – ريما. Имя происходит от слова (и имени) «рим», имеющего много значений, основные из которых: «пена», «накипь», «окалина», «шлак», «белые антилопы». Имя Рим является одним из частых имен в арабском мире (им называют из-за значения «белая антилопа») – в Иордании оно заняло 43-ое место в 2009 году.

37. Рувейда رويدة (ударение на второй слог). Имя является женской формой слова «рувейд» (уменьшительная форма от «руд» — «медленность») и уменьшительной формой от «рада» — «молодая красивая девушка». Обычно пишется через «алиф» на конце – رويدا. «Рувейда» («рувейдан») также означает «помедленней, не спеши» и используется в Коране. В суре «ат-Тарикъ» Аллах сказал:

فَمَهِّلِ الْكَافِرِينَ أَمْهِلْهُمْ رُوَيْدًا

«Предоставь же неверующим отсрочку, помедли с ними недолго!»

С

38.  Сакина سكينة (ударение на второй слог), «спокойствие, тишина; штиль».

Сакиной звали одну из сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم, сестру Саъда бин Аби Ваккаса (одного из 10 сподвижников, обрадованных раем при жизни). Кроме того, арабами использовалось однокоренное к Сакине имя Сукейна سُكينة .

Сукейна было прозвищем дочери аль-Хусейна, внука пророка صلى الله عليه وسلم, чьей матерью была ар-Рабаб. Говорили, что ее настоящее имя было Амина آمنة  (с ударением на первый слог).

Всевышний Аллах сказал:

وَقَالَ لَهُمْ نَبِيُّهُمْ إِنَّ آيَةَ مُلْكِهِ أَنْ يَأْتِيَكُمُ التَّابُوتُ فِيهِ سَكِينَةٌ مِنْ رَبِّكُمْ وَبَقِيَّةٌ مِمَّا تَرَكَ آلُ مُوسَى وَآلُ هَارُونَ تَحْمِلُهُ الْمَلائِكَةُ إِنَّ فِي ذَلِكَ لآيَةً لَكُمْ إِنْ كُنْتُمْ مُؤْمِنِينَ

«Их пророк сказал им: «Знамением его царствия станет то, что к вам явится сундук с миром от вашего Господа. В нем будет то, что осталось после семьи Мусы и семьи Гаруна. Его принесут ангелы. Это будет знамением для вас, если только вы являетесь верующими» (сура «аль-Бакъара», 248).

39.  Салима سليمة (ударение на второй слог) – «здоровая, нормальная, целая, невредимая». У этого слова есть еще одно значение – «раненая; опасно ужаленная», но оно почти не используется в наше время. Имя редко встречается в арабских странах в наши дни.

40.  Салиха صالحة (ударение на первый слог), «благочестивая». Среди молодого поколения в арабских странах это имя почти не встречается (в отличие от его мужской формы – имени Салих صالح ). Раньше же им называли, причем довольно часто.

Салиха бинт Абдулла бин Али аль-Мардини ат-Туркмани была мухаддисой, умершей в девятом веке по хиджре. Мухаддисами были Салиха бинт Абдиллях аль-Макъдисия, Салиха бинт Али аль-Андалуси, Салиха бинт Имадуддин бин Рабиъ аль-Мукъаддим и Салиха бинт Мухаммад аль-Макъдиси.

41.  Сальма سلمى (ударение на первый слог) – одно из наиболее древних и частых арабских имен. Этим именем звали несколько сподвижниц пророка صلى الله عليه وسلم, а также многих известных женщин, живших после него. Оно происходит от корня «син-лям-мим», и однокоренные к нему имена – Сильм سلم , Салям سلام , Саляма سلامة , Саляма سلمة , Салим سليم , Салима سليمة , Салем سالم , Салема سالمه , Муслим مسلم , Муслима مسلمة , Саллюм سلوم , Мусаллям مسلّم , Сальман سلمان , Сулейман سليمان , Сулейма سليمى , Саллям سلاّم , Йислям يسلم, Ислам إسلام и др.

Таким образом, его основное значение берется от слова «саляма سلامة » — «благополучие, здравость».

42. Сальсабиль سلسبيل (ударение на последний слог) – название источника в раю. Аллах сказал в суре «аль-Инсан»:

فَوَقَاهُمُ اللَّهُ شَرَّ ذَلِكَ الْيَوْمِ وَلَقَّاهُمْ نَضْرَةً وَسُرُورًا

وَجَزَاهُمْ بِمَا صَبَرُوا جَنَّةً وَحَرِيرًا

مُتَّكِئِينَ فِيهَا عَلَى الأَرَائِكِ لا يَرَوْنَ فِيهَا شَمْسًا وَلا زَمْهَرِيرًا

وَدَانِيَةً عَلَيْهِمْ ظِلالُهَا وَذُلِّلَتْ قُطُوفُهَا تَذْلِيلا

وَيُطَافُ عَلَيْهِمْ بِآنِيَةٍ مِنْ فِضَّةٍ وَأَكْوَابٍ كَانَتْ قَوَارِيرَا

قَوَارِيرَا مِنْ فِضَّةٍ قَدَّرُوهَا تَقْدِيرًا

وَيُسْقَوْنَ فِيهَا كَأْسًا كَانَ مِزَاجُهَا زَنْجَبِيلا

عَيْنًا فِيهَا تُسَمَّى سَلْسَبِيلا

Аллах защитит их от зла того дня и одарит их процветанием и радостью.

А за то, что они проявили терпение, Он воздаст им Райскими садами и шелками.

Они будут лежать на ложах, прислонившись, и не увидят там ни солнца, ни стужи.

Тени будут близки к ним, и плоды будут подчинены им полностью.

Обходить их будут с сосудами из серебра и кубками из хрусталя –

хрусталя серебряного, соразмерных размеров.

Поить их там будут из чаш вином, смешанным с имбирем,

из источника, названного Сальсабилем.

43.  Самира سميرة (ударение на второй слог), «собеседница; женщина, ведущая самар – ночной разговор».

44.  Самия سامية (ударение на первый слог), «высокая, возвышенная, высочайшая». Популярность этого имени идет на спад, и сейчас им называют не особо часто.

45.  Сания سنية (ударение на второй слог), «высокая, величественная, высочайшая». Это имя не считается популярным в арабском мире в наше время, но раньше в некоторых арабских странах оно часто использовалось.

46.  Сара سارة . Как и Марьям, это имя распространено у мусульман, христиан и иудеев. Единственное отличие – что в некоторых христианских странах, в том числе России, имя считается сугубо еврейским, и поэтому христиане им обычно не называют.

В тех же местах, где так не считают, Сарами часто называют и христиане.

В США имя Sarah всегда было одним из самых частых: в 1880 году оно занимало десятое место по популярности, в 1982 – четвертое, а в 2009 – двадцать первое. Что касается его другого варианта написания, Sara, то в 1880 году оно было на 110-ом месте, в 1978 – на двадцать восьмом, а в 2009-ом – на 106-ом.

Его значение на иврите – «принцесса (амира)». На арабском же есть два похожих слова, которые часто приводят как значение этого имени:

سارّة – «сарра» — «радующая» и

سأرة – «остаток».

В Иордании в 2009-ом году имя Сара было на четвертом месте. В ряде других стран, в том числе в Саудовской Аравии, это имя также на протяжении длительного времени продолжает оставаться одним из самых частых.

47.  Сафия صفية (ударение на второй слог), «чистая, ясная, прозрачная; подруга». Имя многих сподвижниц и благочестивых женщин нашей уммы, живших после них.

48.  Сирин سيرين (ударение на последний слог). Это неарабское имя, и точное его значение нигде не упоминается. В исламскую историю оно вошло вместе с Сирин, сестрой наложницы пророка صلى الله عليه وسلم Марии аль-Къубтии. Марию и Сирин пророку صلى الله عليه وسلم подарил мукъаукъис (правитель) Египта. Марию пророк صلى الله عليه وسلم определил для себя, а Сирин стала наложницей Хассана бин Сабита. Она родила ему его сына Абдуррахмана.

49.  Султана سلطانة (ударение на предпоследний слог) – женская форма слова «султан سلطان »: «власть, господство; верховный правитель». Этим именем очень редко называют в наше время, в отличие от его мужского эквивалента – популярного во многих странах имени Султан.

50.  Сумайя سمية – имя первой шахиды в исламе, Сумайи бинт Хайят, Умм Аммар. Ее имя является уменьшительной формой от двух слов: сама («небо») и самия («возвышенная»).

Т

51. Тасним تسنيم (ударение на последний слог). Как и Сальсабиль, это тоже название райского источника. Аллах сказал в суре «аль-Мутаффифин»:

إِنَّ الأَبْرَارَ لَفِي نَعِيمٍ

عَلَى الأَرَائِكِ يَنْظُرُونَ

تَعْرِفُ فِي وُجُوهِهِمْ نَضْرَةَ النَّعِيمِ

يُسْقَوْنَ مِنْ رَحِيقٍ مَخْتُومٍ

خِتَامُهُ مِسْكٌ وَفِي ذَلِكَ فَلْيَتَنَافَسِ الْمُتَنَافِسُونَ

وَمِزَاجُهُ مِنْ تَسْنِيمٍ

عَيْنًا يَشْرَبُ بِهَا الْمُقَرَّبُونَ

«Воистину, благочестивые окажутся в блаженстве

и будут созерцать на ложах.

На их лицах ты увидишь блеск благоденствия.

Их будут поить выдержанным вином,

запечатанным мускусом. Пусть же ради этого состязаются состязающиеся!

Оно смешано с напитком из Таснима – источника, из которого пьют приближенные».

У

52.  Умейма أميمة (ударение на второй слог)древнее арабское имя, являющееся уменьшительной формой от двух слов: «умм أم » — «мать» и «умама أمامة » — «триста верблюдов». Было несколько сподвижниц с таким именем.

Ф

53.  Фарах فرح (ударение на первый слог), «радость». В некоторых мусульманских регионах это имя может использоваться как мужское.

54.  Фарида  فريدة (ударение на второй слог), «жемчужина; редкостная, бесподобная вещь; уникальная».

Это имя используется в Египте чаще, чем в остальных арабских странах. Это может быть связано с тем, что с 1938 по 1949 гг. Фаридой звали жену тогдашнего короля Фарукъа (настоящее ее имя было Сафиназ Зуль-Факъар), которая родила трех принцесс: Фирьяль, Фаузию и Фадию.

Этим же именем зовут первую внучку нынешнего египетского президента Хосни Мубарака.

Х

55.  Хабиба حبيبة (ударение на второй слог) – древнее арабское имя с ярко выраженным смыслом – «любимая». Это имя носило большое количество сподвижниц, среди них:

  • Хабиба бинт Аби Умама Асъад бин Зурара, жена Сагля бин Ханифа;
  • Хабиба бинт Аби Тиджрат аль-Абдария, от которой передавались хадисы;
  • Хабиба бинт Джахш, родная сестра Зейнаб бинт Джахш, жены пророка صلى الله عليه وسلم;
  • Хабиба бинт Умм Хабиба Рамля бинт Аби Суфьян, дочь жены пророка صلى الله عليه وسلم;
  • Хабиба бинт Хариджа бин Зейд аль-Хазраджия, жена Абу Бакра رضي الله عنه, мать его дочери Умм Кульсум. Она была последней женой Абу Бакра, и он умер, когда она была беременна на Умм Кульсум;
  • Хабиба бинт Аби Суфьян;
  • Хабиба бинт Аби Амир ар-Рагиб, сестра известного сподвижника Ханзали, которого омывали ангелы после его смерти на поле боя;
  • Хабиба бинт Набих бин аль-Хаджжадж ас-Сагмия, жена аль-Мутталиба бин Аби Вадаа, мать Хабибы бинт аль-Мутталиб, и другие сподвижницы.

Это же имя носили многие известные мусульманские женщины средних веков – Хабиба бинт Ибрагим аль-Макъдисия, мухаддиса седьмого века по хиджре, Хабиба бинт Аби Халяф, Хабиба бинт аль-Изз и другие.

Что касается распространения этого имени в современном арабском мире, то в некоторых странах, например, в Египте, им называют очень часто, а в других (Саудия) редко.

56.  Хаджар (Гаджар) هاجر (ударение на первый слог). Это имя одной из жен пророка Ибрагима عليه السلام, матери его первенца, Исмаила. От Ибн Аббаса رضي الله عنهما передается хадис пророка صلى الله عليه وسلم, рассказавшего удивительную историю Хаджар: «Ибрагим привёл мать Исмаила вместе с её сыном Исмаилом, которого она ещё кормила грудью, и оставил её у Дома рядом с большим деревом(, росшим) над (тем местом) в верхней части мечети(, где впоследствии забил) Замзам. В то время в Мекке никого не было, как не было там и воды, и он оставил их там, оставив им мешок фиников и бурдюк воды. А потом Ибрагим повернулся и двинулся (в обратный путь), что же касается матери Исмаила, то она последовала за ним(, восклицая): «О Ибрагим, куда же ты уходишь, бросая нас в этой долине, где нет людей и (вообще) ничего нет?!», — и она много раз повторила (эти слова), но он даже не повернулся к ней. Потом она спросила его: «Аллах ли повелел тебе сделать это?» Он сказал: «Да». Она сказала: «Тогда Он не даст нам пропасть!», после чего вернулась (к Исмаилу), а Ибрагимعليه السلام  пошел (дальше), достигнув же ас-Санийи, где они не (могли) видеть его, он повернулся в сторону Дома и обратился с мольбой к Аллаху, воздевая руки к небу и (произнося такие слова):

رَبَّنَا إِنِّي أَسْكَنْتُ مِنْ ذُرِّيَّتِي بِوَادٍ غَيْرِ ذِي زَرْعٍ عِنْدَ بَيْتِكَ الْمُحَرَّمِ رَبَّنَا لِيُقِيمُوا الصَّلاةَ فَاجْعَلْ أَفْئِدَةً مِنَ النَّاسِ تَهْوِي إِلَيْهِمْ وَارْزُقْهُمْ مِنَ الثَّمَرَاتِ لَعَلَّهُمْ يَشْكُرُونَ

«Господь наш, поистине, поселил я часть своего потомства в долине, где ничего не растёт, у Твоего Заповедного дома. Господь наш, пусть они совершают молитву, и склони к ним сердца (некоторых) людей и надели их плодами, чтобы они благодарили (Тебя)!»

Аллах ответил на дуа Ибрагима عليه السلام, и после того, как вода у Гаджар закончилась, когда она бегала 7 раз между холмами ас-Сафа  и аль-Марва, Аллах послал ангела, которых взмахнул крылом, и из земли забил источник, названный Замзамом.

Гаджар продолжала жить в этом месте (Мекке), и с ее позволения там поселилось племя джургум. Ее сын, Исмаил, женился на одной из женщин этого племени, она родила ему 12 сыновей, и один из них был предком пророка Мухаммада صلى الله عليه وسلم.

57.  Халима حليمة, «кроткая, мягкая, терпеливая» (ударение на второй слог). Больше всех это благородное имя прославила Халима из бану Саъд, кормилица пророка صلى الله عليه وسلم, которая воспитывала его практически все 4 первых года его жизни. Она была дочерью Абу Зуэйба Абдуллы бин аль-Хариса. По прошествии лет, когда пророк صلى الله عليه وسلم уже получил пророчество и находился в аль-Джаъране, к нему пришла женщина-бедуинка. Она приблизилась к нему, и он расстелил для нее свой плащ, и она села на него. Один человек спросил: «Кто это?», и ему сказали: «Это его мать, которая вскормила его».

Халима бинт Урва бин Масъуд ас-Сакъафи была сподвижницей или табиинкой.

58.  Ханин حنين (ударение на последний слог) – «страстное желание; тоска; жалость; вздох». Это однокоренное к Ханан имя стало популярным сравнительно недавно. В Иордании в 2009 году оно заняло 46-ое место по популярности.

Ш

59.  Шарифа شريفة (ударение на второй слог), «благородная».

60.  Шейма  شيماء (ударение на последний слог). Также используется вид имени с «аль» — аш-Шейма الشيماء. Слово «шейма» означает «обладающая хорошими качествами; женщина с родинкой (или родимым пятном)». Изначально аш-Шейма было прозвищем молочной сестры пророка صلى الله عليه وسلم, одной из двух дочерей Халимы ас-Саъдии, кормилицы пророка صلى الله عليه وسلم. Ее настоящее имя точно неизвестно – возможно, ее звали Хузафа или Джудама.

Я

61.  Ясмин ياسمين – имя персидского происхождения, которое давно и прочно вошло в обиход в арабских странах. Ясмин бинт Салем бин Али бин аль-Бейтар аль-Хузеймия – одна из передатчиц хадисов, которая передавала от Хибатуллы бин аш-Шибли и умерла в 634 г.

Если «ясмин» означает растение жасмина, то «Ясмина ياسمينة » — одна ветка этого растения или один его цветок.

В арабских странах нашего времени почти всегда называют просто Ясмин. В истории своим благочестием и умом прославилась Ясмина ас-Сиравандия, а также Ясмин бинт Абдулла аль-Халебия, мухаддиса восьмого века по хиджре.

Zoho CRM. Обзор / Хабр

Мое знакомство с CRM началось около года назад, когда клиент впервые заказал мне внедрить CRM для управления отношениями с клиентами. Для начала мы анализировали различные CRM для выбора оптимальной: Amo CRM, Sugar CRM, Sales Force и многие другие были мною протестированы. После двух недель анализа мы выбрали Zoho CRM по многим причинам, которые будут раскрыты в этой статье.

За год я внедрил Zoho CRM на 8 различных проектах и получил большой опыт по работе с этой системой, которым хочу с вами поделиться. В данной статье я дам обзор Zoho CRM и попытаюсь объяснить структуру, из чего состоит эта система, почему мой выбор пал именно на нее, какие нюансы есть в работе с системой. Я постараюсь избегать строгих формулировок и объяснять все доступным языком. Итак, начнем.

Что такое CRM?

Для начала стоит разобраться с самим понятием CRM. CRM — это аббревиатура, которая расшифровывается как Customer Relationship Management (система управления взаимоотношениями с клиентами). Существует много определений, что такое CRM. Здесь я приведу то, которое мне кажется наиболее точным. Я его ранее приводил в своей статье

Guinness — “Идеальная пинта пива”. Кейс превосходного CRM решения.
Система CRM, которую часто называют также менеджментом клиентов, является бизнес-подходом. Его цель — создание, развитие и укрепление отношений с тщательно выбранными клиентами, увеличение выгоды клиента, повышение корпоративной прибыли, а значит, и максимизация прибыли инвесторов.

(из книги «Руководство по CRM. Путь к совершенствованию менеджмента клиентов». Автор Эдриан Пейн).

Таким образом, CRM — это целый комплекс инструментов, мероприятий, информационных технологий, направленных на достижение цели: создать, развить и укрепить отношения с клиентами. Zoho CRM — часть этого комплекса, его IT составляющая. Zoho CRM предоставляет клиенту возможность заниматься тем, что он умеет лучше всего: продажами. Автоматизацию рабочих процессов Zoho берет на себя.

Лицензии

Zoho CRM — это saas решение, то есть работа программы осуществляются только через web-браузер, и никакие программы на компьютер пользователя не устанавливаются.

UPD: Вы можете попробовать Zoho CRM совершенно бесплатно если зарегистрируетесь по ссылке.

Для начала работы с Zoho CRM необходимо купить лицензию. Лицензия нужна для того, чтобы иметь доступ к системе на один месяц или год. Каждая лицензия дает право подключаться по логину и паролю сколько угодно раз, например, с компьютера, ноутбука и смартфона. Лицензирование происходит по пользователям, т.е. одна лицензия соответствует одному пользователю, заведенному в CRM. Можно запустить сколько угодно одновременных сессий под одним пользователем. Это важно понимать, чтобы определить количество лицензий, которое необходимо купить. Например, если в компании 3 руководителя, которые пользуются только отчетами в CRM сиcтеме, 3 лицензии покупать не нужно, достаточно будет одной. Но количество пользователей, зафиксированных в Zoho CRM, не может быть больше количества лицензий, это надо понимать. То есть, чтобы дать доступ новому пользователю, необходимо либо деактивировать другого пользователя, либо купить новую лицензию.

Подписка

http://



Версии поставки Zoho CRM

С количеством лицензий разобрались, теперь необходимо выбрать тариф.

Zoho CRM предлагает 4 тарифа: Standart, Professional, Enterprise, CRM Plus. От выбранного тарифа зависит функционал CRM системы. Я считаю Enterprise оптимальным тарифом, в котором есть все необходимые функции для среднего и малого бизнеса. Стоимость одной лицензии Enterprise для малого и среднего бизнеса приемлемая и на момент написания статьи составляет 35 долларов в месяц на одного пользователя.
http://
Что нам дает Enterprise? В этой версии есть все функции Standart и Professional плюс дополнительные функции, без которых трудно представить себе работу CRM. При внедрении CRM для меня критичным моментом является возможность интеграции с телефонией. И начиная только с Enterprise версии такая интеграция возможна. В версиях Standart и Professional интеграция с телефонией не предусмотрена. Я не буду останавливаться на всех преимуществах Enterprise по отношению к другим версиям. Подробнее о возможностях каждой системы вы можете узнать здесь.

После того, как вы выбрали тип лицензии, необходимо понять, каковы составляющие Zoho CRM и каковы ее возможности. Функционал системы очень внушителен, и описать все не позволяет формат статьи. Поэтому я пройдусь по тем составляющим и тем возможностям Zoho CRM, которые были мною задействованы на проектах и которые я считаю наиболее значимыми при работе с системой.

Составляющие системы

Администратор и Пользователи

Пользователь — тот, кто имеет доступ к системе. Имея уникальный логин и пароль, пользователь может войти в Zoho CRM неограниченное количество раз с разных устройств. Пользователи бывают двух типов:


  • Администратор.

Администратор обладает полным доступом к Zoho CRM и может настраивать права доступа, а также контролировать других пользователей, настраивать модули и внешний вид системы, подключать плагины, сторонние системы и т.д. Правами администратора должен обладать пользователь, который будет настраивать систему. Очень важно, что вы никогда не потеряете доступа к системе. Бывает, что у администратора случайно устанавливают не администраторские права, и не могут попасть в систему. Такого в Zoho CRM быть не может: здесь у администратора невозможно снять полный доступ к системе. В Zoho всегда есть один администратор. Система это контролирует.


  • Остальные пользователи.

Они могут иметь или не иметь ограничения к пользованию системой. Необходимо понимать, что к пользователям привязываются все совершенные ими действия, что очень удобно для фиксирования и анализа данных, прогнозирования процессов, формирования отчетности по сотрудникам и определения их эффективности.

Модули

Модули — это сущность, через которую происходит вся работа в системе Zoho CRM. Это как кирпичи, из которых система состоит. Модули представлены в системе в виде вкладок, внешний вид которых настраивается. В модулях есть поля. Среди полей вы увидите “Имя”, “Фамилия”, “Номер телефона, “Email”, “Статус”, “Стадия сделки” и другие. В Zoho вы можете добавлять свои собственные поля. Поля имеют широчайшие возможности настройки и организации. Но вернемся к модулям. В Zoho CRM существует 2 типа модулей:


  • Предустановленные (базовые) модули.

Это модули, установленные самой системой, они имеют свою логику работы с системой. Функциональность базовых модулей ограничена: некоторые вещи в них просто нельзя изменить. Среди базовых модулей, к примеру, Leads (Лиды), Contacts (Контакты), Accounts (Контрагенты), Tasks (Задачи).


  • Пользовательские модули.

Это модули, созданные пользователем. Они изменяются свободно, не имея никаких ограничений на редактирование. Можно создать модуль и вывести его в виде таба (нами, например, был создан собственный модуль СМС-сообщения, который содержал все смс, отправленные клиенту). Модули создаются в специальном приложении Zoho Creator, которое интегрируется с Zoho CRM, но об этом чуть позже. В системе может быть создано неограниченное количество модулей.

http://

4 базовых модуля

Лид (Lead)

— это потенциальный клиент, проявивший каким-либо образом интерес к вашей компании. Это самая первая стадия при работе. Это еще не клиент, но с ним уже проводится работа. Как контакт его заводить пока рано. Лиды генерируются из разных источников. Список источников включает в себя выставки, email кампании, web-формы, холодные обзвоны, директ-маркетинг и другие. Лиды могут быть созданы вручную или автоматически (например, при заявке с сайта, отправленной через встроенную веб-форму, или при звонке с неопределенного номера). Можно к этому лиду автоматически привязать задачу (например, “Позвонить лиду”) и сделать, чтобы эта задача шла на определенного менеджера. С лидом проводится работа, после которой он может быть конвертирован в Контакт или Контрагент и в Потенциальную сделку.

Контакт (Contact)

— это человек, с которым непосредственно взаимодействует пользователь. Контакт — стержневой модуль всей системы, который отвечает за любые взаимодействия с клиентом. Контакты являются источником силы любого бизнеса. Поэтому, чем больше информации о клиенте, тем более успешным будет бизнес. Модуль Контакты в Zoho CRM является мощным, персонализированным способом сохранить всю необходимую контактную информацию в одном окне. В модуле Контакт есть все, что нужно знать о клиенте:

  • Номера телефонов
  • Эл. письма
  • Задачи
  • Напоминания
  • Списки дел
  • Документы
  • И многое другое

Как это работает? Представим, что контакт звонит пользователю. На экране пользователя высвечивается Имя контакта, и пользователь может открыть карточку этого контакта, где в одном окне будет представлена вся информация по клиенту: его последние заказы, последние взаимодействия с ним, открытые задачи по контакту. Таким образом, пользователь в ходе разговора сможет выстроить логику работы с данным контактом. По завершении входящего вызова система сохранит этот звонок в перечне взаимодействий и предложит создать задачу с напоминанием.

Контрагент (Account)

— это организация, компания, связанная с контактом. Одному контрагенту может подчиняться несколько контактов. В основном вся работа с клиентами ведется в модуле Контакты, но модуль Контрагенты нужен для того, чтобы группировать работу по компании в целом. Модуль Контрагенты также состоит из настраиваемых полей, но здесь в отличие от Контактов содержится юридическая информация конкретной организации.

Потенциальная сделка (Potential)

— это модуль, который отвечает за контроль над сделками в целом и который отслеживает конкретную сделку в цепочке продаж. Здесь можно фиксировать, на какой стадии находится сделка, какова вероятность выиграть сделку, история сделки, сумма сделки, ответственный и т.д. Поля здесь также, как и в других модулях, настраиваются.

Работа со сделкой в Zoho CRM

Сейчас я расскажу, как выглядит пошагово сделка в Zoho CRM.

  1. Обычный процесс продаж начинается с кампании для генерации лидов. Это может быть email кампания, выставка, реклама в яндекс или других системах продвижения.
  2. В Zoho CRM вручную или автоматически создаются лиды на основе полученных данных. Это может быть заполненная заявка на сайте, входящее email сообщение или визитка. Вы можете прописать правило в Zoho CRM, чтобы при создании лида ему уходило email сообщение с приветствием.
  3. Лиды назначаются разным пользователям (у каждого лида есть ответственный пользователь). Пользователи получают задачи по работе с лидами. Это может быть сделано вручную или автоматически (если прописано соответствующее правило). В задаче указывается тема, срок выполнения, тип операции, которую необходимо выполнить и, конечно, лид, к которому привязана данная задача.
  4. Пользователи работают с лидами: выполняют звонки, отправляют email или смс, проводят встречи, фиксируя все взаимодействия в системе.
  5. Далее необходимо квалифицировать лиды, нерабочие лиды нужно удалить из системы.
  6. После того, как произошли взаимодействия, лид проявил интерес и выявил свой потенциал — он конвертируется в контрагента, контакт и потенциальную сделку. Это происходит нажатием одной клавиши, после этого наш клиент перемещается из модуля Лид в выбранный модуль.
  7. Работа продолжается до тех пор, пока сделка не выиграна. Или не проиграна.

Как видно рабочий процесс достаточно прозрачный и обладает широкими возможностями автоматизации. Теперь я хочу перейти к функциям и возможностям CRM, наиболее востребованным на проектах.

Функции и возможности Zoho CRM

Импорт данных

Особое внимание хочу уделить импорту данных. Импорт данных в Zoho CRM не составляет никакого труда, ограничения на импортирование данных нет. Процесс очень простой и быстрый. Вы загружаете файл в формате XLS или CSV, сопоставляете поля и загружаете данные. Имена полей в Zoho CRM — это заголовки колонок вашей таблицы. Очень удобно, что всегда можно взять и отменить операцию, все данные, которые были в этом импорте — будут удалены из системы.

API

API — это первое, на что я обращал внимание при выборе CRM системы. Что такое API? Это инструмент интеграции одного программного обеспечения с другим. Мне очень понравилось описание API в Zoho CRM, мне очень понравилась их документация, сервисы, которые они предоставляют. CRM система — это не вещь в себе, она должна существовать в рамках единого информационного поля, она должно быть хорошо интегрируема. И если система хороша сама по себе, но плохо интегрируется, то эта система не подойдет. API в Zoho CRM очень удобный и дает отличные возможности интеграции с различными сервисами.

http://

API обладает определенными лимитами. В зависимости от выбранного тарифа Zoho CRM количество данных, которые можно выгружать или загружать, варьируется.

Минимум, который вы можете использовать в версии Enterprise — 4000 запросов в день на организацию.
Максимум — 25 000 запросов в день на организацию или 500 запросов на одного пользователя, причем ограничение стоит на меньший показатель.

Одним запросом одновременно возможно:

  • добавить или прочесть до 200 записей
  • удалить или обновить до 100 записей

То есть если у вас 3 пользователя, то вы можете сделать 3*500= 1500 запросов. 1500 меньше минимума, равного 4000, значит, вы можете сделать 4000 запросов.

Если у вас 10 пользователей, то вы можете сделать 10*500= 5000 запросов. 5000 больше минимума, равного 4000, но меньше максимума, равного 25 000 — вы можете сделать 5000 запросов.

В максимум вы сможете упереться только при количестве пользователей больше 50.

Благодаря отличному API, Zoho CRM, как я уже говорил, интегрируется с совершенно различными сервисами. Рассмотрим некоторые из них.

Интеграция с телефонией

Одна из вещей, которая очень важна для клиента при работе с CRM и без которой нельзя представить себе CRM систему, по моему мнению, — это автоматическая фиксация всех возможных взаимодействий сотрудников с клиентом по телефону:


  • фиксирование входящих звонков в системе, их продолжительность
  • инициирование исходящих звонков из системы
Внешний вид входящего вызова

http://



Внешний вид исходящего вызова

http://


Многие CRM системы потому и не “взлетели”: сложно себе представить, чтобы сотрудник вручную забивал все данные по своим звонкам. В Zoho CRM с этим все в порядке.

Zoho CRM интегрируется с телефонией посредством технологий PhoneBridge. CRM можно интегрировать с различными системами телефонии, на момент написания статьи это:

  • Avaya
  • Asterisk
  • Elastix
  • Twilio
  • Ringio

На всех проектах мною была проведена интеграция Zoho с системой Asterisk. Процесс достаточно легкий и простой, так как Zoho предоставляет все необходимые средства. Остальные системы телефонии я не проверял, потому что Asterisk стал для меня стандартом качества.

Интеграция с смс-агрегаторами

Интеграция с смс-агрегаторами в Zoho CRM происходит методом webhook. Webhook — это один из инструментов, который позволяет интегрироваться с наиболее распространенными системами без написания строчек кода. Вы создаете webhook, указываете параметры (например, контакт, номер телефона, текст смс, транслит) и привязываете к определенному событию.

Внешний вид webhook

http://


Например, вы хотите отправить СМС пользователю с уведомлением о создании лида. Сервис Webhook позволяет упростить эту задачу, отправляя уведомления третьей стороне при каждом создании нового события внутри CRM. Таким событием может быть что угодно: создание контакта, закрытие бизнес-сделки или обновление запроса клиента.

Скорость работы системы очень высокая, я не заметил никаких проблем.

Интеграция с почтовыми провайдерами email рассылки

Zoho предоставляет по умолчанию интеграцию c Zoho Campaigns и Mailchimp. Одна из самых удобных функций заключается в том, что при рассылке система автоматически вычисляет нерабочие email-адреса и сама уведомляет пользователей. Если, например, email адрес клиента забит неправильно, или адрес больше не существует, то при рассылке система выявит эти адреса и пришлет уведомление пользователю. Адрес можно будет уточнить и исправить, либо удалить.

Интеграция Zoho CRM с другими сервисами Zoho.

Компания Zoho является разработчиком многих замечательных сервисов помимо Zoho CRM, и предоставляет интеграцию с ними, которая настраивается в несколько кликов. Часть моих клиентов использует ZOHO Campaigns для email рассылок, Zoho Project для ведения проектов. С интеграцией не возникло никаких проблем, все работает из коробки, и продумано очень хорошо.

Интеграция с другими продуктами Zoho

http://


Интеграция с 1с

Одна из очень важных возможностей Zoho CRM — это интеграция с 1с. Благодаря API интеграция происходит достаточно легко. Интеграция с 1с позволяет не заносить клиента дважды: мы заносим его только в Zoho CRM, а в 1с клиент появляется автоматически. Благодаря этому пользователь не теряет время, выполняя двойную работу, избегает ошибок и дублирования данных.

http://

В свою очередь из 1с в Zoho CRM передается бухгалтерская информация: счета, заказы, баланс и др. Так на одном проекте у меня была интересная задача: заказчику необходимо было, чтобы в Zoho CRM при открытии карточки клиента был виден его объем закупок за предыдущий и текущий квартал. На основании этих данных пользователь выстраивает логику работы с клиентом. В карточке клиента были созданы соответствующие поля, и информация из 1с загружалась туда и обновлялась по мере изменений. Эта задача была решена без особых проблем.

Как мы видим, Zoho CRM, действительно, хорошо интегрируется с различными системами и сервисами, список которых можно еще продолжить. Но перейдем сейчас к другим возможностям, которые предоставляет Zoho CRM.

Zoho Reports

Уделю внимание такому инструменту, как Zoho Reports. Zoho Reports — это конструктор отчетов для Zoho CRM. С помощью него можно создать практически любой отчет в любом разрезе. В системе существуют базовые отчеты, довольно неплохие, но кроме того, без проблем можно создать и свой отчет. Примеры отчетов Zoho Reports:


  • по менеджерам и группам менеджеров
  • по продуктам и группам продуктов
  • по выручке
  • по звонкам: их результативности, длительности, теме и пр.
  • по сделкам: их стадиям, суммам, вероятности выиграть
  • по задачам: их стадиям, срокам выполнения
  • временные отчеты: за день, неделю, месяц
  • и много-много других отчетов.

Панель отчетов в Zoho CRM

http://


http://

Zoho Creator

Необходимо отметить также такой инструмент, как Zoho Creator — система для создания собственных приложений внутри Zoho. Creator спокойно интегрируется с Zoho CRM. Как это работает, покажу на примере. У меня есть клиент — сеть салонов красоты. У них есть так называемая Запись на услуги. В Zoho Creator было создано приложение Запись клиента, в котором были созданы свои поля. В том числе в одном из полей можно указать ссылку на контакт в Zoho CRM. Эта Запись клиента была выведена как отдельный модуль. Zoho Creator — тема отдельной статьи, но могу сказать, что эта система обладает очень широкими возможностями.

Внешний вид Zoho Creator

http://


Web-формы

Большинство бизнесов базируются он-лайн и требуют web-форм для того, чтобы привлекать лидов с лендинговых страниц, собирать обратную связь от посетителей и приглашать клиентов на последующие события. В Zoho CRM процесс создания web-форм очень простой: он осуществляется при помощи сервиса построения форм путем перетаскивания полей. Это позволяет построить контактную форму сайта или анкету самостоятельно. Нужно просто перетянуть необходимые поля, используя сервис встроенного редактора WYSIWYG. Вы также можете загружать файлы, отмечать обязательные для заполнения поля, вставлять поля для дополнительных данных, используя скрытые поля и многое другое.

Табы

Табы — это вкладки в верхнем меню Zoho. Табы являются ключевым элементом интерфейса, через который выводится вся информация, с которой работает пользователь. Табы бывают двух видов:


  • табы системы Zoho. Они выводят в качестве вкладок модули самой системы
  • web-табы. Они выводят в качестве вкладки сторонние сайты
Как выглядит web-таб

http://


Табы Zoho и web-табы могут быть совмещены в одной панели, и пользователь может настроить порядок табов, их названия и видимость так, как ему будет удобно.

Также Zoho CRM позволяет создавать группы вкладок, содержащие набор табов, объединенных каким-либо признаком. Например, группа вкладок для менеджеров по продажам представляет собой один набор табов, группа вкладок для руководителя — совсем другой набор.

Workflow

Благодаря Workflow можно автоматизировать все рутинные процессы Zoho CRM путем написания правил. Например, клиент хочет автоматически отправлять email новым лидам, оставившим свои контактные данные на сайте. Достаточно создать новое правило, в котором нужно указать необходимый модуль (в нашем случае это Лид), время для выполнения действий (при создании), и тип операции (у нас это Email, здесь необходимо выбрать шаблон письма). Это достаточно простой пример, Workflow дает гораздо более широкие и разнообразные возможности автоматизации.

Внешний вид Workflow

http://


Служба поддержки

http://

Скажем так. Я восхищен службой поддержки Zoho CRM. И хотя отвечают в основном индусы (как я могу догадываться по имени в чате и фото), помогают они здорово. Общаться приходится на английском, но моим клиентам было достаточно google переводчика для общения со службой поддержки. Очень радует, что общение происходит по чату, и почти всегда оператор отвечает в течение минуты. Историю общения они потом высылают на почту вместе с необходимой информацией.

В завершение статьи еще раз отмечу, что функционал Zoho CRM внушителен, и описать все не позволяет формат статьи. Подведем итоги: почему же Zoho CRM — это отличный инструмент для управления отношениями с клиентами и почему я его рекомендую:

  • Zoho очень гибкая и хорошо настраиваемая система
  • Стоимость лицензии приемлема для малого и среднего бизнеса
  • Отличный API, дающий возможности интеграции с совершенно различными системами и сервисами
  • Автоматизация рабочих процессов на высшем уровне
  • Возможность создания web-форм без программирования
  • Отличная локализация на русском языке

Новое от 17.04.2015: Интеграция с телефонией теперь есть и в тарифе

Professional

http://


Новое от 17.09.2018: сайт о ZOHO официального партнера ZOHO

ztrinion.ru

Горшком или Аванчелом — МК

Не прошло и года с тех пор, как член Совета Федерации Валентина Петренко внесла в Госдуму законопроект, запрещающий родителям назвать ребенка именем, содержащим ненормативную лексику, цифровые, буквенные обозначения и аббревиатуры, как, говоря современным электоральным языком, на Охотном Ряду пошла движуха. Закон приняли в первом чтении.

Еще Ильф и Петров, Чуковский и Булгаков почти сто лет назад вразумляли теряющих от счастья рассудок родителей, чтобы они в стремлении увековечить исключительность своего ребенка не глумились над ним, называя Аванчелом (авангард человечества) или Долокапом (долой капитализм).

Даздраперм (да здравствует Первое мая), Лапанальд (лагерь папанинцев на льдине) теперь, пожалуй, не встретишь, а многие Вили, Владлены, Октябрины благополучно дожили до наших дней.

У нас в стране все народы на протяжении веков не жалели усилий по придумыванию для своих детишек красивых имен: например, у калмыков — Бююрчи (установщик кибитки), Дондук (мужество), Болда (стальной), у бурятов — Агвандодуб (исполняющий желания всех живых существ), Базаржаб (защищенный алмазом), Регби (умный) и так далее. Теперь, когда депутаты озаботились благозвучностью, список, наверное, пошерстят. Хотя, опять же, имя Крымнаш разве не услаждает многие сердца?

А называть дитя цифрами в общем-то глупо. Об этом государство уже позаботилось, присваивая каждому младенцу при рождении номер индивидуального налогоплательщика — ИНН, а позже еще и пенсионно-страховой, любовно называемый в народе СНИЛС. Вполне можно использовать, например, номер ИНН как имя, а СНИЛС как отчество, если родители сразу позаботятся о получении номера. Или наоборот. Длинновато, конечно, но можно ведь использовать в качестве уменьшительно-ласкательного имени три или четыре цифры.

Сами же слова ИНН и СНИЛС по новому закону употреблять будет нельзя — аббревиатуры в первом чтении попали под запрет. Женское имя Инна использовать, наверное, будет можно, а мужское Инн — нельзя.

Впрочем, насчет аббревиатур не всем депутатам идея понравилась. Как сообщил коллегам депутат Айрат Фаррахов, такие имена-аббревиатуры распространены в Татарстане. К ним относятся Ренат (революция, наука, труд), Дамир (да здравствует мировая революция), Ленар (ленинская армия), Рамиль (рабочая милиция), Эльмира (электрификация мира). По данным органов ЗАГС по Республике Татарстан за 2016 год, такими именами названы более 5 тысяч детей.

С другой стороны, столетиями известно, что в переводе с арабского, откуда произошло имя Ренат, оно означает «рожденный заново», а Ленар — «свет Аллаха». Наверное, при регистрации младенцев родителям будет устраиваться допрос с пристрастием: а что вы подразумеваете под этим именем? Эмиль — это «эмбарго на поставку Илов» или это наш Емеля?

К счастью, или в данном случае к несчастью, еще с древних времен у многих народов (в германском, славянском, иранском, древнегреческом языках) сложилась традиция прославлять людей при помощи специально созданных двухосновных имен. Так что не только у татар, но и у русских семей набралось много составных имен: Святослав, Ярослав, Вячеслав, Любомир, Владимир — всех не перечесть. Их тоже под запрет?

Приводят пример, как одна продвинутая московская семья — наверное, заглядывающая во времена, когда будет поголовная чипизация, — назвала своего мальчика БОЧ рВФ 260602, что расшифровывается как «биологический объект человека рода Ворониных—Фроловых, родившийся 26 июня 2002 года». ЗАГС не принял это идеальное имя будущего, и мальчик, говорят, до сих пор безымянный. Что характерно, ЗАГСу вроде как хватило ума принять такое решение без всяких законов.

В общем, не зря, видно, целый год шла работа над этим непростым законопроектом. Предыдущая Дума, уходя, оставила порядка 2000 законопроектов, которые так и не были приняты. Может, и этот законопроект при таких темпах рассмотрения останется в запасниках?


Семен Семеныч

 

Осенило

• Современные средства связи объединяют людей, но разъединяют поколения.

• Жадность — качество, которое всегда переходит в количество.

• Век, может, и золотой, но очень уж низкопробный.

• Можно, подобно Авгию, прославиться даже нечищеными конюшнями, если в роли имиджмейкера выступает Геракл.

• Один в поле не воин, а мишень.

• Капля никотина убивает лошадь, а капля елея — Пегаса.


Иван Иванюк

 

Ведущий — Джангули ГВИЛАВА, E-mail: [email protected]

Читать онлайн «Все дело в кепке» автора Маргаритова Рита — RuLit

Условились играть на двадцать гривен. Ленка выиграла. В карточные и прочие настольные игры она редко выигрывала, но сейчас, видимо, с любовью было совсем плохо, поэтому в нарды ей повезло.

— Слушай, а у меня денег нет. Давай еще сыграем, мне отыграться надо. — Ленку разозлили бы эти слова, если бы их сказал кто-то другой. Но в Рамиле была такая настоящая неподдельность, искренность и наивность, что злиться на него Ленка просто не могла.

— Я не хочу больше играть, деньги можешь мне не отдавать, — улыбнулась Ленка.

— Нет, это не честно, если не хочешь больше играть. Мне надо отдать тебе деньги, а у меня их нет…

— Ага, замкнутый круг, — заметил Саша.

Ленка посмотрела в сторону их стоянки: костер уже прогорел, и все, кажется, разошлись по палаткам. А Ленке спать совсем еще не хотелось.

— Лен, а хочешь, я тебе погадаю? — с блеском в глазах предложил Рамиль. — Знаешь, как мое имя расшифровывается? Гадающий на песке.

— Погадай, — улыбнулась Ленка. Рядом с этими забавными ребятами она улыбалась все время. — На песке гадать будешь?

— Песка тут нет, на камнях погадаю. Пойдем к морю, а ты, Саш, тут подожди: гадание — процесс почти интимный.

— У тебя сейчас все хорошо, — неторопливо начал Рамиль.

— Начало многообещающее…

— Не перебивай меня, пожалуйста. Так вот. У тебя сейчас все хорошо, потому что что-то в тебе меняется. Ты в начале… — Рамиль замолчал. Молчал он долго, Ленка даже успела подумать, что это гашиш наконец начал действовать и больше она ничего от него не услышит. Но Рамиль очнулся, пристально посмотрел на Ленку. — Ладно, все это для тебя не важно. Скажу только, что тот, кто может стать твоим всем, сейчас совсем рядом с тобой. Ты сомневаешься, любишь ты его или нет, ты боишься отпустить свое прошлое. Ты не предпринимаешь ничего, ты боишься. А бояться не надо, поверь мне. — Рамиль опять замолчал. Потом, прищурившись, посмотрел на Ленку: — А я даже, кажется, знаю, о ком ты вздыхаешь. Это тот невысокий мужчина с бородой. Новенький.

Ленка была шокирована:

— Постой, ты что, и правда умеешь гадать?

— А ты мне, значит, не поверила. Ну спасибо тебе. — Рамиль сделал вид, что обиделся.

— Да нет, почему… поверила… я вообще в такие вещи верю, но… все равно это очень странно.

— Да ладно, шучу я, — засмеялся Рамиль. — Я просто видел, как вы вместе плавали, как ты смотрела на него.

Ленке опять было бы впору разозлиться, но вместо этого она удивилась еще сильнее. «Интересно, если это заметил совершенно посторонний мальчик-наркоман, то неужели этого не замечают остальные? И если он не сомневается в моих чувствах к Жану, то почему я сама в них сомневаюсь?»

— Я вижу, ты обалдела. — Рамиль все еще смеялся. — Наверное, тебе надо поспать. Давай, пока, целую, до завтра.

— Да, счастливо. Увидимся.

Глава девятая

Юля проснулась, но не решалась пошевелиться. «А вдруг Илья еще не ушел, увидит, что я проснулась, и все пропало. Господи, что «все пропало»? Еще ведь и не было ничего. Может, этот пират и не приплывет больше». От последней мысли Юле стало тоскливо. Она осторожно приоткрыла глаза и вздохнула с облегчением — Кораблева уже не было рядом.

Мучиться ожиданием Юле долго не пришлось, она даже понервничать перед желанной встречей толком не успела.

— Привет, — широко улыбнулся Жан Юле. — Это тебе. — Он протянул ей большую красивую ракушку. — Извини, цветы по дороге купить было негде.

— Привет, — ответила Юля и поняла, что больше ей сказать совершенно нечего. Она начала нервничать и краснеть совершенно некстати. Будто можно было покраснеть кстати!

Жан же прекрасно знал, о чем и как надо говорить. Он говорил долго, но Юля не слушала его слова. Она слышала его голос, низкий, бархатный, сексуальный голос.

Потом Юля так и не могла вспомнить ни слова из их беседы. Она долго еще боялась себе признаться, что это она первая поцеловала пирата, а вовсе не он ее. Ей было и стыдно, и приятно вспоминать, как поцелуй превратился из робкого в страстный и вечный. Как этот поцелуй пронзал губы, пронзал все тело. Это было так не похоже на их спокойный секс с Кораблевым, на мягкий, уютный секс, без приступов уродливой страсти, на секс, когда не было ничего лишнего, но все же чего-то не хватало. Юля улыбалась сама себе: «Я всегда знала, что во мне живет хищник, во мне живет кошка». Их секс с Жаном был диким, жадным и совершенно не красивым. Настоящая животная страсть не бывает красивой.

Стэнтон Рамиль анонсирует предстоящий визит в Теннесси

Тренер линии нападения из Теннесси Глен Эларби обратил внимание на быстрорастущего атакующего игрока Стэнтона Рамиля из Алебастра, штат Алабама. Теннесси присоединился к ним в конце февраля после впечатляющего выступления в Under Armour Camp.

«Переговоры с Теннесси идут очень хорошо. На самом деле я собираюсь поехать туда с визитом и с нетерпением жду этого», — сказал потенциальный клиент Волквесту.«Я много общался с тренером Эларби. Все идет отлично, и я налаживаю отношения со всеми тренерами».

Рамиль никогда не был в Ноксвилле, но это скоро изменится завтра, так как потенциальный клиент 2023 года планирует прибыть в город. При росте 6 футов 7 дюймов и весе 305 фунтов многое может понравиться в длинном атакующем снаряжении и в том, как он может вписаться в схему добровольца.

«Единственное, что им действительно нравится, — это моя способность двигаться, будучи таким большим», — сказал Рамиль. «Это было большим в моем наборе.Им нравится моя стойкость и то, как много я получаю после этого.

«Мне тоже нравится идея ехать быстро. Вот такой я игрок. Мы много бегаем [в темпе] здесь, в Томпсоне, так что я к этому привык. Этот тип нападения с быстрым ударом мяча — это то, чем я занимаюсь».

Этой весной трехзвездный отель был занят: он уже зарегистрировался в Оберне, штате Оле-Мисс и штате Миссисипи. Недавно он заезжал в Вирджинию, Питтсбург и Дьюк. Он будет в Теннесси завтра и, возможно, в Северной Каролине на этих выходных.

Весна будет решающим периодом для лайнмена нападения, поскольку он продолжает получать необходимую информацию о каждой программе, которая может быть в финальном забеге. Но не ждите решения в ближайшее время.

«Я думаю о нескольких официальных визитах летом, но не думаю, что буду близок к решению до начала сезона», — сказал потенциальный клиент. «Я действительно хочу посмотреть, как работают эти программы в течение сезона, чтобы увидеть, где они находятся, и увидеть, действительно ли то, о чем они говорят, происходит.В сезон можно многое увидеть».

Рамиль относительно недавно на Юге. Выросший примерно в часе езды к югу от Сиракуз, он и его семья переехали в Алабаму прошлым летом. Будучи юниором в 2021 году, линейный игрок нападения штата выиграл чемпионат штата 7-A с Томпсоном.

«Это было настоящее безумие. Я приехал сюда и начал тренироваться против лучших защитников в стране. Это было безумие», — размышлял проспект. «Я увидел, как меня сравнивали с ними, и я становился все лучше и лучше каждую неделю на протяжении всего сезона.

Переезд из Бингемтона, штат Нью-Йорк, в штат Алабама был не чем иным, как футбольным бизнес-решением для будущего спортсмена Power 5.

«Приезжая с севера, [вербовка] действительно отличается. Я помню, как был там и думал, как мне повезло, что Сиракузы проявляют интерес», — объяснил Рамиль. «У нас здесь семья, и в Нью-Йорке действительно сложно найти сотрудников. Как только разразился COVID, футбол почти закрылся. Мой папа просто хотел дать мне лучшую возможность».

Район не новый, однако, для семьи Рамиль.Тетя Стэнтона живет в Бирмингеме, его отец играл за «Багровый прилив» в конце 1980-х, а обе его сестры в настоящее время играют в баскетбол в «Сэмфорде». Алабама проявила интерес к потенциальному покупателю, но пока не предложила.

Занимая 23-е место в общем зачете в штате и 35-е место в рейтинге 2023 года, Рамиль взволнован своей завтрашней остановкой в ​​Теннесси.

«С точки зрения футбола, я действительно с нетерпением жду возможности увидеть, как складываются отношения с игроками», — сказал тэкл.«Хочу посмотреть, как тренируют тренера. Я хочу посмотреть, похожа ли это на семейную атмосферу, и стремятся ли они стать первоклассной командой SEC».

И тренерский штаб производит хорошее первое впечатление.

«Я думаю, что он отличный тренер и отличный парень. Мне понравилось с ним разговаривать», — сказал Рамиль о Джоше Хьюпеле. «И судя по моим разговорам с тренером Эларби, он действительно семейный парень. В первый раз, когда я разговаривал с ним, он сказал, что уходит из церкви со своими атакующими линейными.Это огромная вещь для меня».

Рамиль имеет рейтинг Rivals 5,7.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Максимизация рекомбинации в популяциях макадамии для создания карт сцепления для закрепления генома

Реферат

Род Proteaceae Макадамия имеет недавнюю историю одомашнивания в качестве коммерческой ореховой культуры. Мы стремились создать первые гаплоидно-коррелированные эталонные карты генетического сцепления на основе последовательностей для этой преимущественно ауткроссирующей многолетней древесной культуры с плотностью маркеров, подходящей для закрепления генома. Были использованы четыре популяции первого поколения, чтобы максимизировать модели сегрегации, доступные в потомстве полных сибсов, двух родителей и самоопылении.Это позволило нам объединить данные о сегрегации из перекрывающихся подмножеств из > 4000 информативных маркеров, помеченных последовательностями, чтобы увеличить эффективный охват кариотипа, представленного обнаруженными событиями рекомбинантного кроссинговера. Все карты имели 14 групп сцепления, соответствующих числу гаплоидных хромосом макадамии , и позволяли закреплять и ориентировать каркасы последовательностей для создания сборки псевдохромосомного генома макадамии. Сравнение отдельных карт показало высокий уровень соответствия, при этом незначительные несоответствия были удовлетворительно устранены в рамках интегрированных карт.Комбинированный набор карт значительно улучшил плотность маркеров и долю (70%) закрепленной сборки последовательности генома. В целом, расширение нашего понимания генетического ландшафта и генома этой ореховой культуры представляет собой значительный прогресс в области генетики и геномики макадамии. Набор карт, большое количество маркеров, основанных на последовательности, и реконструированный геном обеспечивают набор инструментов для будущей селекции, которая должна помочь расширить индустрию макадамии, а также предоставить ресурсы для долгосрочного сохранения естественных популяций в восточной Австралии этого уникального растения. род.

Тематические термины: Науки о растениях, Генетика растений

Введение

Семейство растений Гондваны Proteaceae включает 83 рода и более 1600 видов 1 . Macadamia был первым родом в семействе, который был одомашнен, хотя другие виды также культивируются для получения съедобного ядра ( Gevuina ) или для декоративного использования (например, Protea , Telopea , Banksia ). Долгоживущие деревья австралийских субтропических тропических лесов M.integrifolia (Maiden & Betche) и M. tetraphylla (LAS Johnson) и их гибриды лежат в основе производства орехов макадамии. Несмотря на коммерческое значение, существует ограниченное понимание структуры генома и генетической основы адаптивных признаков 2 . Макадамия является диплоидной, с зарегистрированным гаплоидным числом хромосом 14 3 , 4 . Хотя на кистях образуются массовые цветки, завязывается менее 5% этих плодов 5 , и наблюдается частичная самонесовместимость 6 , 7 .За последние десять лет мировое производство макадамии росло быстрее, чем любая другая культура лесных орехов, и в настоящее время на ее долю приходится около 3% мировой торговли орехами 8 . Растет потребность в разработке новых сортов, отвечающих стандартам урожайности и качества, а также в расширении культивирования для более широкого диапазона условий выращивания 9 . Способность селекционеров повышать урожайность, устойчивость к вредителям и болезням, а также устойчивость к различным условиям окружающей среды значительно повышается за счет сопоставления локусов признаков и лежащих в основе генетических вариаций с геномом 10 .

Карты генетического сцепления являются мощным ресурсом, который может повысить эффективность селекции за счет определения относительного хромосомного расположения генов, лежащих в основе ключевых фенотипических признаков, и помощи в разработке селективных маркеров, которые могут иметь особое значение для многолетних культур с длительным периодом генерации. В частности, карты плотных связей остаются ценными для закрепления и ориентации каркасов последовательностей всего генома, картирования локусов количественных признаков (QTL) и предоставления информации для сравнительных геномных и эволюционных исследований 11 14 .Учитывая, что карты сцепления представляют собой распределение хиазматических кроссоверов (COs), возникающих в результате родительской мейотической рекомбинации, они дают ценную информацию о вкладе, который каждый набор родительских аллелей может вносить в последующее потомство. Их также можно использовать для клонирования на основе карт, чтобы оценить скорость интрогрессии специфических аллелей и определить вероятность перетаскивания сцепления между локусами 15 .

Широко признано, что порядок маркеров и длина карт генетического сцепления могут различаться в пределах вида, и представление о том, что одна карта сцепления представляет точное распределение вариаций рекомбинации для вида, ошибочно 16 .Несоответствия в порядке маркеров между картами неизбежны, поскольку каждая карта основана на сегрегации аллелей, возникающей в результате независимых родительских мейозов, возникающих в результате конкретного скрещивания, используемого для создания карты.

Многие ранние карты сцепления для ряда видов были построены с использованием ограниченного числа молекулярных маркеров и часто не имели достаточной плотности или разрешения для точного картирования QTL, MAS или привязки генома 17 . Внедрение секвенирования ДНК следующего поколения (NGS) и генотипирования с помощью генерации маркеров секвенирования (GBS) привело к созданию многих пересмотренных карт сцепления с повышенной плотностью и разрешением маркеров, что улучшило последующие приложения карт сцепления.

Первые карты генетического сцепления макадамии были построены с использованием 328 произвольных амплифицированных маркеров RAF и RAPD и одного меченого маркера STMS из потомства 56 F 1 HAES ‘246’ x HVP ‘A16’ 18 . Однако из-за низкой плотности маркеров и отсутствия маркеров на основе последовательностей их нельзя было использовать для обнаружения QTL или привязки генома. Это подчеркивает потребность в надежных, плотных картах сцепления, разработанных с использованием маркеров на основе последовательностей, чтобы обеспечить точное отражение родительских мейозов, всесторонний охват каждой хромосомы и селективные маркеры, представляющие ценность для будущих программ разведения.

Был создан проект сборки генома M. integrifolia сорта HAES ‘741’, состоящий из 193 493 каркасов общей длиной 518 мегабаз (Мб) 2 . После последующих улучшений самая последняя сборка «741» включает 4098 каркасов общей длиной 744 Мб 19 . Однако нет информации об относительном расположении или ориентации этих каркасов по отношению к кариотипу отдельных хромосом.

Имеются данные о том, что карты генетического сцепления на основе SNP из нескольких популяций могут в сочетании максимизировать привязку генома и ориентацию 20 , 21 . Мы сравнили способность нескольких родительских карт и интегрированных карт для конкретных сортов повышать плотность маркеров и точность порядка маркеров по сравнению с отдельными картами сцепления. Мы также исследовали родительский вклад в наблюдаемую вариацию скорости рекомбинации и относительную надежность и конгруэнтность индивидуальных и интегрированных карт.В целом, этот подход позволил нам разработать серию карт генетического сцепления, которые охватили диапазон рекомбинации из четырех популяций и обеспечили подходящую плотность маркеров на основе последовательностей для закрепления последовательностей сборки генома. Насколько нам известно, эти геномные ресурсы платформы представляют собой первую гаплоидно-коррелированную генетическую связь и физические карты макадамии, основанные на последовательностях, и внесут значительный вклад в будущие программы селекции и исследования макадамии.

Материалы и методы

Растительные материалы

Было создано четыре картирующих популяции с использованием самостоятельных и двуродительских скрещиваний сортов макадамии (рис.) с обычным родительским сортом M. integrifolia («741»). Этот сорт ранее использовался в качестве эталонного генотипа для секвенирования и сборки генома 2 и был получен на Гавайской сельскохозяйственной экспериментальной станции (HAES). Популяции включали невыбранное потомство от самоопыляемого ‘741’, а также двухродительских скрещиваний ‘741’ и гибридных сортов M. integrifolia M. tetraphylla ‘A268’ и ‘A4’ с плантаций Hidden Valley (HVP). , Австралия (рис.). Эти кроссы были выбраны, чтобы отразить родительские различия по ряду экономически важных признаков 22 , 23 . Популяции содержались в исследовательских центрах Департамента сельского хозяйства Квинсленда в Маручи, Намбуре и Бандаберге, а также в Университете Южного Креста, Лисмор, Австралия.

Макадамия популяций, использованных для создания карт генетического сцепления в этом исследовании. На рисунке показаны материнские и отцовские сорта и количество потомков для каждого скрещивания.

Сорт ‘741’ был выбран из гавайского сада саженцев Дешванден, и его происхождение неизвестно 24 . Предыдущие генетические данные указывают на то, что «741» является чистым M. integrifolia 25 , 26 . Сорт «A268» представляет собой гибрид F1 M. integrifolia и M. tetraphylla , а «A4» также является гибридом с примерно 25% содержанием M. tetraphylla . Родителями «А4» являются F1 M.integrifolia – M. tetraphylla гибрид «Renown» и M. integrifolia «Собственный выбор» 22 , 27 .

Приблизительно один грамм материала молодых листьев был собран, по крайней мере, в 2 повторностях каждого родительского сорта и от каждой особи в пределах четырех картируемых популяций. Листовой материал сушили 10-кратным по весу влажным силикагелем с самоиндикацией и запечатывали в индивидуальные повторно закрывающиеся пластиковые пакеты. Образцы хранили в герметичных пластиковых контейнерах при комнатной температуре с заменой гидратированного силикагеля по мере необходимости.

Экстракция ДНК

Полную геномную ДНК экстрагировали с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit или набора DNeasy 96 Plant Kit (Qiagen Inc. Valencia, США) примерно из 20  мг сухого листового материала в соответствии с ранее описанными методами 7 .

Материал зрелых склерофиллезных листьев обрабатывали в отдельных пробирках, поскольку было трудно получить требуемую концентрацию и качество ДНК с помощью метода титрационного микропланшета DNeasy 96. В некоторых случаях отдельные экстракты или объединенные множественные экстракты концентрировали с использованием концентратора Eppendorf Concentrator 5301 (Eppendorf AG, Гамбург) для получения минимальной концентрации 50 нг/мкл, необходимой для последующего анализа.Для небольшого количества образцов на колонки загружали несколько лизатов для увеличения концентрации. Количественное определение ДНК проводили с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000/2000c (Thermo Fisher Scientific Inc) и анализа Qubit dsDNA BR (Life Technologies, Карлсбад, США).

Создание данных маркеров

Генотипирование маркеров было проведено компанией Diversity Array Technologies Ltd. с использованием методологии DArTseq 28 . DArTseq — это быстрая и экономичная платформа для обнаружения генетических маркеров и генотипирования, нацеленная на неповторяющиеся области и широко используемая для картирования генетического сцепления растительных культур 29 .Методы соответствовали ранее оптимизированным и описанным для макадамии с использованием PstI  +  HhaI снижения сложности генома для создания кодоминантных SNP и маркеров доминантного присутствия-отсутствия (PAV) последовательности длиной 64 пары оснований (bp) 30 .

Фильтрация маркеров

Исключение маркеров из набора данных было основано на следующих параметрах. Маркеры исключали, если имело место: несоответствие между биологическими или техническими репликами родительских генотипов, или более 10% отсутствующих значений в потомстве, или двусмысленная или невозможная сегрегация (имели аллельные комбинации, несовместимые с менделевской сегрегацией от соответствующих родительских гамет).Параметры контроля качества, предоставленные DArT, как указано Barilli, et al . 29 применяли, а маркеры с воспроизводимостью >90%, частотой вызовов >90% и средним содержанием полиморфной информации (PIC) > 0,25 сохраняли для картирования генетического сцепления.

Построение карты связей

Программа JoinMap 5.0 31 , 32 использовалась для построения всех карт связей. Собственная карта «741» была построена с использованием гетерозиготных маркеров SNP, закодированных для популяции перекрестного опыления (CP).Информация о фазах, сгенерированная в JoinMap для каждого маркера, затем использовалась для перекодирования маркеров для популяции F2. Карта F2 была сгенерирована с использованием алгоритма многоточечного отображения правдоподобия, функции отображения Косамби с настройками по умолчанию, частоты рекомбинации, рассчитанной с максимальным числом итераций 200, и допуском рекомбинации 1,0 e -0,8 . Маркеры, которые демонстрировали значительно искаженную сегрегацию (P < 0,01), удаляли, если соседние маркеры, сегрегирующие для одного и того же родителя, не демонстрировали искажения.

Материнские и отцовские карты были построены с использованием отфильтрованных сегрегирующих маркеров SNP и PAV для биродительских скрещиваний («741» x «A4»), («741» x «A268») и («A268» x «741»). Эти карты были сгенерированы для каждого родителя индивидуально в JoinMap с использованием уже описанных параметров.

Интеграция карт для четырех карт «741» и двух карт «A268» была выполнена с использованием алгоритма регрессионного картирования с настройками по умолчанию в JoinMap.

Чтобы определить согласованность порядка маркеров на картах, были рассчитаны коэффициенты ранговой корреляции Спирмена.Каждая из родительских карт «741» сравнивалась с собственной картой «741», а обе карты «A268» сравнивались с картой «A4» для проверки соответствия карт.

Искажение маркера было оценено критерием согласия хи-квадрат с пороговым значением p 0,01 в JoinMap. Количество маркеров SNP, показывающих искажение сегрегации, подсчитывали для каждой из родительских карт и собственной карты «741». Карта MapChart v2.3 33 использовалась для иллюстрации областей искажения сегрегации (SD) на собственной карте «741».

Частота кроссинговера

Количество и распределение явных кроссинговеров (COs) оценивали путем визуального опроса цветных (графических) выходных данных генотипирования JoinMap. Очевидные CO, основанные на количестве наблюдаемых обменов для каждого генотипа, были зарегистрированы для всего потомства в каждой группе сцепления на шести родительских картах. Также были зарегистрированы особи без явных СО в группе сцепления и доля дистальных СО (в пределах 10% длины группы сцепления).

Привязка каркасов

ALLMAPS — это метод, который настраивает каркасы последовательностей для максимизации коллинеарности маркеров, расположенных на картах физического и генетического сцепления 34 . Несколько карт сцепления могут быть включены в один прогон, а каркасы упорядочены и ориентированы для создания последовательностей, которые согласуются с входными картами сцепления.

Для создания сборки физического генома макадамии в масштабе хромосом информация о карте генетического сцепления использовалась для упорядочения и ориентации 4098 каркасов из M.integrifolia ‘741’ v2 геномная сборка [репозиторий Европейского нуклеотидного архива (EMBL-ENA), номер сборки: ERS2953073] с использованием программного обеспечения ALLMAPS 34 . Программному обеспечению требовалось два набора данных в качестве входных данных: (1) генетическое положение в сантиморганах (сМ) маркеров на всех девяти картах и ​​(2) физическое местоположение маркеров, используемых в генетической карте сборки генома v2, полученное с помощью маркерной последовательности. выравнивание по опорам. Эти наборы данных были сведены в таблицы и сохранены в виде текстовых файлов со значениями, разделенными запятыми, для использования ALLMAPS.Выходные данные ALLMAPS, сгенерированные для каждой карты, предоставили упорядоченные и закрепленные каркасы для каждой группы связей и выявили несоответствия в порядке маркеров между картами связей.

Консенсусная физическая карта была создана в ALLMAPS с использованием функции слияния из информации о связях собственной карты «741» и шести родительских карт. Это интегрировало порядок каркасов на основе порядка маркеров на входных картах и ​​увеличило количество маркеров, доступных для упорядочивания и закрепления каркасов генома.Были испытаны четыре различные схемы взвешивания. Оптимальный режим взвешивания был выбран на основе достоверности карты, конгруэнтности и количества закрепленных и ориентированных каркасов. Последовательность хромосомной шкалы была построена в ALLMAPS с соседними скаффолдами, соединенными промежутками в 100 Ns. Карты были объединены со следующими весами: вес 3 для собственной карты «741», вес 2 для родительских карт «741» и вес 1 для родительских карт гибридных сортов «A4» и «A268». Группы сцепления впоследствии были упорядочены в псевдохромосомы на основе соответствия между генетическими и физическими картами, относительного размера в мегабазах и согласованности распределения маркеров по картам.

Чтобы определить взаимосвязь между генетическим и физическим расположением маркеров на картах генетического сцепления, на этот раз последовательности маркеров были сопоставлены с псевдохромосомами консенсусной карты, созданной ALLMAPS, при этом положение маркера определялось при пороговых значениях выравнивания ≥ 80% покрытие запросов, >90% идентичность последовательности, битовая оценка ≥40 и значение e <1e -6 . Генетическое положение маркеров как на интегрированной карте «741», так и на интегрированной карте «A268» затем наносили на график относительно физического положения маркеров в парах оснований (п.н.) вдоль одной и той же псевдохромосомы.

Результаты

Картирование популяций

Потомство было отнесено к картированию популяций на основе анализа отцовства с использованием маркеров DArT SNP и методов, описанных ранее 7 . Доля потомства, не отнесенного к ожидаемому скрещиванию, колебалась от 5,6% до 43,3% (таблица S1 ). Самооплодотворение было обнаружено как в популяциях «741» х «А268» (3,3%), так и в популяциях «741» х «А4» (5,6%), но не в популяции «А268» х «741». Для картирования была выбрана подгруппа из 299 особей из четырех различных популяций (рис.).

Информация о маркерах

Для четырех популяций были получены нефильтрованные данные по 6071 SNP-маркерам и 10071 PAV-маркерам. Маркеры были сначала отфильтрованы, чтобы удалить те, которые не совпадают по генотипу между родительскими репликами. В трех двухродительских популяциях 47% информативных маркеров SNP предполагали невозможную сегрегацию (имели аллельные комбинации, несовместимые с менделевской сегрегацией от соответствующих родительских гамет) и были исключены из дальнейшего анализа. Кроме того, от 3 до 25% маркеров имели отсутствующие данные и еще 7.5–24% были удалены на основе PIC, воспроизводимости или частоты вызовов. После фильтрации качества для удаления маркеров низкого качества 901 («741» self), 3805 («741» x «A4»), 3 533 («741» x «A268») и 2 650 («A268» x «741») информативных маркеры были определены для соответствующих популяций (таблица S2 ).

Типы сегрегации

Самокарта «741» была построена на основе самой большой популяции (n = 116) с использованием гетерозиготных SNP-маркеров. Биродительские популяции позволили провести независимое исследование мужских и женских мейозов.Сходные пропорции (38–40%) предварительно отфильтрованных маркеров были полиморфными в каждой из популяций с одинаковой гетерозиготностью SNP у родителей 0,18 («741» и «А268») и 0,16 («А4»). После качественной фильтрации от 2 до 4% доступных маркеров в двухродительских популяциях расщепляются с кодоминантным соотношением F2 1:2:1, 16–18% расщепляются с соотношением обратного скрещивания 1:1 и 80% расщепляются с коэффициентом кодоминантности F2 1:2:1. доминирующее соотношение 3:1. В целом, 20 % отфильтрованных маркеров, доступных для картирования, были SNP, а 80 % — PAV (таблица S2 ).Приблизительно в два раза больше маркеров находились в соединении по сравнению с фазой отталкивания для «741» и «А4», в то время как 25% маркеров находились в соединении для «А268» (таблица S3 ).

Составление карты

Карты родственных связей между самцами и родителями

Доступ к данным о сегрегации из различных типов популяций дал возможность разработать ряд карт, отображающих рекомбинационное поведение в различных контекстах. Всего было построено девять карт генетического сцепления, в том числе одна самостоятельная, три материнских, три отцовских и интегрированные карты для каждого из сортов «741» и «А268» (таблица).Каждая карта включала 14 групп сцепления, соответствующих гаплоидному числу хромосом Macadamia 3 . Собственная карта «741» была построена исключительно с кодоминантными маркерами SNP, в то время как родительские карты включали как маркеры SNP, так и маркеры PAV.

Таблица 1

Сводная статистика генетического сцепления Macadamia , интегрированных и консенсусных карт ALLMAP и привязки генома.

7 956 Отцовская карта была самой длинной из карт «741» (1906 сМ) с большинством маркеров (568), сопоставленных с уникальным положением. Средние интервалы маркеров варьировались от 0,30 до 0,5 маркеров на сМ на родительских картах, но были самыми высокими (0,66) на собственной карте «741». Некоторые группы сцепления (LG11 и 12 на Карте 3, LG13 на Карте 2 и LG01 на Карте 4) включали меньше маркеров. Для сравнения, гибридные родительские карты были длиннее, в диапазоне от 1262 сМ (отцовский «А268») до 3662 сМ (материнский «А268»). Карта «A4» включала наибольшее количество маркеров (1929), хотя только 852 из них были сопоставлены с уникальными местоположениями по сравнению с 1210 уникальными местоположениями для маркеров на материнской карте «A268».Плотность маркеров гибридных родительских карт варьировалась от 0,33 до 0,45 маркеров на сМ (таблица).

Интеграция карт увеличивает плотность маркеров

Интеграция маркеров из нескольких родительских карт может увеличить как количество доступных маркеров, так и плотность маркеров. Сначала были исследованы родительские карты, и гомология групп сцепления между картами была определена на основе общих маркеров, что позволило интегрировать данные из соответствующих групп сцепления в отдельных популяциях (таблица).Интегрированные карты для сортов «741» и «A268» включают информацию о сегрегации из карт компонентов и обеспечивают более высокую плотность маркеров по сравнению с картами компонентов. Интегрированные карты включали наибольшее количество маркеров и общую плотность маркеров (таблица, рис. ).

Распределение маркеров на картах генетического сцепления. ( a ) Карта 1 (741 × 741), ( b ) Карта 8 (интегрированная ‘741’) и ( c ) Карта 9 (интегрированная ‘A268’). Желтыми участками на Карте 1 обозначены области искажения сегрегации.Шкала в сантиморганах (сМ). Группа сцепления (LG).

Хотя длина интегрированной карты «741» (Карта 8) была аналогична каждой из материнских карт «741», она включала в общей сложности 1445 маркеров, из которых 1277 (88%) представляли уникальные позиции на карте. Это привело к более высокой плотности маркеров (1,5 маркера на сМ), чем у родительских карт «741» (0,30, -0,46) и собственной карты «741» (0,66). Интеграция обеих родительских карт «A268» уменьшила длину карты (1030 сМ) на 28% и увеличила плотность маркеров до 1.93 маркера на сМ по сравнению с 0,33 и 0,42 маркера на сМ для родительских карт «A268» (таблица).

Соответствие карты поддерживает порядок маркеров

Соответствие порядка расположения маркеров между картами является показателем надежности карты и точности порядка. Конгруэнтность была определена с использованием ранговой корреляции Спирмена (ρ) (таблица S4 ) и была высокой между «741» (карта 1) и «741» материнской картой (карта 2, среднее по группам сцепления ρ = 0,93, n = 16) , p < 0,01). Самый низкий уровень сравнений (ρ = 0.77, n = 9, p < 0,05) наблюдалось между Картой 1 и отцовской картой «741» (Карта 4). Это, по-видимому, связано преимущественно с тремя группами сцепления, несущими небольшое количество общих и тесно связанных маркеров (LG10, 0,44, LG11, 0,2 и LG12, 0,0). Группа сцепления 05 материнской карты «741» (карта 3) также имела низкую конгруэнтность с картой 1 (ρ = 0,22, n = 16, p > 0,05). Как и ожидалось, интегрированная карта «741» (карта 8) имела полное соответствие (ρ = 1,0, n = 59, p < 0,01) с картой 1.

Для гибридных карт конгруэнтность была самой высокой (ρ = 0.82, n = 37, p < 0,01) между отцовской картой «A4» (карта 5) и отцовской картой «A268» (карта 6). Однако для LG12 корреляцию установить не удалось из-за отсутствия общих маркеров. Средняя конгруэнтность была выше (ρ = 0,8, n = 99, p < 0,01) между Картой 7 и Картой 6, чем между Картой 5 и Картой 7 (ρ = 0,75, n = 30, p < 0,01). Там, где конгруэнтность была низкой, это отражало меньшее количество тесно связанных маркеров на одной из карт (рис., таблица S4 ).

Искажение сегрегации

Собственная карта «741» (карта 1) была особенно ценна для обнаружения вариаций SD, поскольку она была построена исключительно с использованием кодоминантных SNP-маркеров.Области SD были идентифицированы с использованием критерия хи-квадрат для обнаружения отклонений от ожидаемой менделевской сегрегации (рис. ). Всего 143 (16%) маркера были расположены в пределах семи отдельных областей SD в шести группах сцепления, в том числе двух на LG03. Доказательства для областей SD были подтверждены при плотности не менее одного маркера на сМ, от семи маркеров, охватывающих 4 сМ (LG05), до 34 маркеров, охватывающих 31 сМ (LG10).

Основываясь на данных нескольких карт, оказалось, что существуют значительные различия в способности SNP-маркеров обнаруживать SD на разных картах.Доля таких маркеров варьировалась от 1–1,5% на родительских картах «741» и увеличивалась на картах «А268» самцов (3,3%), «А4» самцов (4,3%) и «А268» самок (8,8%). .

Частота кроссинговера

Частота кажущегося кроссовера (CO) была рассчитана путем подсчета предсказанных генетических CO для каждой группы сцепления на каждой родительской карте (рис. , таблица S5 ). На родительских картах CO не был обнаружен в одной или нескольких группах сцепления у 29–51% потомства. В обследованных мейозах наиболее часто встречались одиночные ЦО, обнаруженные у 21–38% потомства.

Распределение видимых хиазм для родительских карт (карты 2–7). Ось X представляет собой среднее количество хиазм на группу сцепления для каждой карты. Ось Y — процент потомства.

В каждой популяции было зарегистрировано количество одного или нуля СО среди 14 групп сцепления для от 50% до 84% потомства (таблица S5 ). Количество кроссоверов ≥2 на группу сцепления было зарегистрировано для 16–33% потомства на картах, полученных из биродительского скрещивания «741» x «A4», хотя ни одно из них не было обнаружено на LG13 материнской карты «741» (карта 2).Как материнская, так и отцовская карты от биродительского скрещивания «741» x «A268» имели меньшую долю потомства с количеством CO ≥2 (17 и 18% соответственно). Стоит отметить, что в LG11 на Карте 3 и LG01 и LG12 на Карте 6 не было количества CO >1. Однако это может быть связано с относительно небольшим размером популяции «741» x «A268» (n = 35). .

Наибольшая обнаруженная кажущаяся частота CO была обнаружена в популяции «A268» x «741». Количество кроссоверов ≥2 на группу сцепления было зарегистрировано для 31% потомства, вносящего информацию в карту самцов «741» (карта 4) и 50% для карты самок «A268» (карта 7).Количество кроссоверов > 4 было зарегистрировано для более чем 20% потомства для пяти групп сцепления на карте 7 (рис., таблица S5 ). Кроме того, предварительные подсчеты очевидных дистальных СО показывают, что в этих регионах может встречаться большая доля карт, полученных из этого скрещивания (18–20%), по сравнению с картами, полученными из других скрещиваний (9–16%).

Закрепление геномных каркасов

Выравнивание последовательностей маркеров

На основе анализа BLASTn в общей сложности 4266 последовательностей маркеров сопоставлены с 1667 различными каркасами, причем большинство из них картировано в одном уникальном месте внутри уникального каркаса генома (83%, 3529 маркеров) .Еще 12% (512 маркеров) сопоставлены с двумя, 3% (128 маркеров) с тремя каркасами и 2% сопоставлены с более чем тремя каркасами. Два аномальных маркера, картированные на 140 и 92 каркасах соответственно (рис. ), позволяют предположить, что эти маркеры могут быть связаны с транспозоном или другой повторяющейся последовательностью. Распределение маркеров по каркасам не было однородным: от одного (566 каркасов) до 34 (1 каркас) маркеров на каркас, отражающих различия в длине каркаса и плотности маркеров в геноме.В целом, 349 каркасов содержали 2 уникальных маркера, тогда как 193 и 142 каркаса содержали три и четыре уникальных маркера соответственно (рис. ). Выявлена ​​положительная корреляция между длиной каркаса и количеством маркеров (ранговая корреляция Спирмена ρ = 0,68, P = 0,01).

Распределение маркеров, сопоставленных с каркасами. ( a ) каркасы по маркерам, от одного уникального места до 140 различных каркасов. ( b ) маркеров на каркас, от одного до 34 маркеров.( c ) процент каркасов с одним или несколькими маркерами для каждой карты генетического сцепления и консенсусной карты ALLMAP.

Разработка согласованной физической карты псевдохромосом

Семь карт макадамии использовались в ALLMAPS для создания согласованного порядка каркаса (физической карты), приписываемого отдельным хромосомам, путем привязки маркерных последовательностей к M. integrifolia ‘741’ геномные каркасы v2. Консенсусная карта включала 4184 маркера (таблица) со средней плотностью маркеров 8.1 маркер на Мб. При оптимальном весовом режиме 69,7% (519,2 Мб) сборки было привязано к 14 группам сцепления. Всего было заанкерено 1465 строительных лесов, из них 474 лесов N50. Из закрепленных каркасов 609 имели один маркер, а 856 имели ≥2 маркеров и могли использоваться для ориентации. Все каркасы размером более 1 MB (57) были закреплены, как и 94% каркасов с длиной последовательности от 50 kb до 1 MB. Из незакрепленных каркасов 820 были менее 10 000 п.н., из которых 682 были менее 5 000 п.н.

Только автокарта «741» заякорила 33,3% сборки генома. Хотя эта карта была построена полностью с гетерозиготными маркерами SNP из одного сорта, эта карта заякорила 550 каркасов, из которых 246 были каркасами N50. Из них 176 скаффолдов включали ≥2 маркеров (таблица, рис. ).

Последовательное объединение нескольких мужских и женских карт из двухродительских популяций привело к постепенному увеличению доли закрепленной сборки генома. Отцовская карта «741» заякорила 29% генома, включая 213 каркасов N50 и 121 каркас, закрепленных с ≥2 маркерами.Материнские карты от кроссов «741» x «A4» и «741» x «A268» закрепили 39,9% и 32,8% сборки с 687 и 543 каркасами соответственно.

По сравнению с картами M. integrifolia ‘741’, родительские карты, полученные из Macadamia межвидовых гибридных сортов ‘A4’ и ‘A268’, включали относительно больше маркеров и закрепляли и ориентировали большую часть сборки генома (рис. . ). Отцовская карта «А4» закрепляла большую часть сборки генома, чем любая другая карта в отдельности (50.4%), с 381 каркасом, имеющим ≥2 маркеров. На отцовской карте «A268» было закреплено 336 каркасов с ≥2 маркерами (таблица, рис.).

Конгруэнтность между картой физического консенсуса и картами генетического сцепления была оценена в ALLMAPS. В целом, наблюдалась высокая конгруэнтность между индивидуальной картой и картой консенсуса со средней конгруэнтностью (коэффициент ранговой корреляции Спирмена ρ > 0,78, p < 0,01) для каждой из 14 групп сцепления и (ρ > 0,90, p < 0,01) для десяти групп сцепления (табл. ).

Таблица 2

Ранговый коэффициент корреляции Спирмена маркерной конгруэнтности между отдельными картами сцепления и консенсусной картой ALLMAP, а также средняя корреляция для каждой группы сцепления и карты.*P < 0,05, **P < 0,01.

Карта n Анализ Общая длина карты Длина группы связи №Маркеры Уникальные карты на карте Гибель Marker Interval Marker Interval Marker Assumbols на якорь леса на якорь N50 лесов на якорь лесов на якорь
см минимальный CM cM Позиции маркера/cM %
Map 1 Self SNP (741×741) 116 JoinMap (F2) 47,8 72,0 884 555 12,5 0,66 33,3 550 246 176
Карта 2 741 ♀ (741xA4) 51 JoinMap (СР) 1227,0 52,7 159,6 1210 565 16,1 0,46 39,9 687 296 228
Карта 3 741 ♀ (741xA268) 35 JoinMap (CP) 985.5 23,9 127,7 877 365 21,0 0,37 32,8 543 240 158
Карта 4 741 ♂ (A268x741) 97 JoinMap (CP) 1906,4 62,7 208,6 694 568 31,2 0,30 29,0 447 213 121
Карта 5 A4 ♂ (741xA4) 51 JoinMap (CP) 1901.7 75,1 233,7 +1929 852 31,8 0,45 50,4 894 374 381
Карта 6 A268 ♂ (741xA268) 35 JoinMap (СР) 1261,7 17,9 130,5 1797 525 24,3 0,42 46,9 820 355 336
Карта 7 A268 ♀ (A268x741) 97 JoinMap (CP) 3662.1 188,3 520,4 +1701 1210 39,1 0,33 46,4 803 351 318
Карта 8 741 Интегрированный JoinMap (интегрированный) 835,8 50,6 72,6 1445 1277 13,9 1,53 42,8 754 314 279
Карта 9 A268 Интегрированный JoinMap (интегрированный) 1029.8 65,1 92,1 2084 одна тысяча девятьсот девяносто-одна 20,3 1,93 51,7 920 389 389
ALLMAPs Консенсус ALLMAPs (консенсус) 4184 69.7 1465 1465 1465 474 474 856 856

4 0,92

9

4 0.92

9

4 0,98

5 0
LG MB MB MB 1 (741 × 741) карта 2 741 ♀ (741xa4) карта 3 741♀ (741xa268) карта 4 741♂ (A268x741) карта 5 A4 ♂ (741xa4) карта 6 A268♂ (741xa268) карта 7 A268♀ (A268X 741) LG в среднем
N = 116 N = 51 N = 35 N = 35 N = 35 n = 35 n = 97 n = 51 n = 35 n = 97
LG1 2999 ** 0,94 ** ** 0,90 ** 0,85 ** 0,90 ** 0,94 ** 0.89 ** 0
LG2 47 1,00 * * 0,94 ** 0.94 ** 0,95 ** 0.20 0.94 ** 0,91 ** 0,91 ** 0.85
LG3 37 0.98 ** 0.97 ** 0,91** 0,96** 0.98 ** 0,98 ** 0,60435 0,60435

4 0.91
39 0,95 ** 0,95 ** 0,96 ** 0.94 ** 0.98 ** 0.92 * * 0,80435 0,80 ** 0.85 ** 0.91
LG5 44 44 0.94 ** 0.94 ** 0.54 ** 0.54 ** 0.93 ** 0.98 ** 0,95** 0,81** 0.88
LG6
LG6 38 38 0,97 ** 0.90 ** 0,93 ** 0,94 ** 0.96 ** 0.87 ** 0.87 ** 0.90 **
LG7 3 38 38 1,00 ** 0.97 ** 0,95 ** 0.96 ** 0,96 ** 0,94 ** 0.94 ** 0.95 ** 0.66 ** 0,92
LG8 42 0.98 ** 0,90 ** ** 0,95 ** 0,92 ** 0,94 ** 0,95 ** 0,95 ** 0,94
LG9 36 0,99 * * 0.96 ** 0,96 ** 0,95 ** 0,95 ** 0.73 ** 0.92 ** 0.92 ** 0.85 ** 0,91
LG10 41 0.97 ** 0,96** 0,84** 0,90** 0.90 ** 0.94 ** 0,94 ** 0.92
39 0.99 ** 0.98 ** 0.88 ** 0.88 ** 0.76 ** 0.98 **
0.91 ** 0,91 ** 0,90 0,90
LG12 1,00 ** 1,002 ** 0,82 ** 0.78 * 0.78 * 0.81 ** 0.86 ** 0.67 ** 0,50** 0,78
ЛГ13 34 0.98 ** 0,96 ** ** 0,90 ** 0.98 ** 0,91 ** 0.92 ** 0.82 ** 0.88 ** 0,92
LG14 34 1,00 * * 0, 0.99 ** 0,95 ** 0,95 ** 0.73 ** 0.92 ** 0.92 ** 0.86 ** 0,91
Карта Средние 0,93 0.89 0.86 0.86 0.86 0, 0, 0, 0, 0,90

5

4

5

9

Самый слабый средний конгруэнцию наблюдался для LG12 (ρ = 0,78) и появился в основном несоответствию гибридных карт «А268» (карта 6, ρ = 0,67 и карта 7, ρ = 0,50) и с картой 3 (ρ = 0,78). Наименьшее соответствие с консенсусной картой было LG02 отцовской карты «741» (ρ = 0,20). Материнская карта «A268» имела самую слабую среднюю корреляцию в целом с консенсусной картой (ρ = 0.82) в первую очередь из-за низких корреляций в LG03, LG07 и LG12 (таблица , таблица S3 ).

ALLMAPS также использовался для закрепления сборки «741» v2 с использованием обеих интегрированных карт сортов из «741» и «A268». Интегрированная карта «741» заякорилась на 42,8% (754 каркаса, 279 с ≥2 маркерами), а интегрированная карта «A268» заякорилась на 51,7% (920 каркасов, 389 с ≥2 маркерами) (таблица, рис. ).

Для сравнения дистанций физического и генетического сцепления на реконструированных хромосомах М. были нанесены интегрированные карты «741» и «А268».integrifolia , сорт ‘741’ (рис. ). Хотя интегрированная карта «A268» закрепляла большую часть генома из-за более высокой плотности маркеров, чем интегрированная карта «741», несколько групп сцепления показали слабую конгруэнтность между интегрированными картами «741» и интегрированными картами «A268» (рис. ).

Позиции маркеров на интегрированных картах сцепления ‘741’ и ‘A268’ относительно генома M. integrifolia ‘741’. Ось X представляет собой физическое расстояние в порядке хромосом. По оси Y отложено генетическое расстояние в сантиморганах (сМ).Вертикальные линии указывают границы между группами сцепления (LG). и хромосомы (Chr). Стрелка указывает место возможной инверсии.

Между картами «741» и «A268» для LG09, 05, 06, 07 и 02 наблюдалась относительно сильная конгруэнтность, при этом выравнивание на графиках ALLMAP составляло одну или почти одну диагональную линию (рис. ). Остальные группы сцепления показали области отклонения от главной диагонали с наибольшим количеством маркеров, отклоняющихся от линейного выравнивания на карте «A268».Наибольшие отклонения от коллинеарности наблюдались в пределах LG10, LG11, LG01 и LG12, причем внешние маркеры располагались на большем расстоянии от главной диагонали. Группы сцепления 11, 01 и 12 были помещены в конце сборки реконструированного генома как хромосомы (Chr) 12, 13 и 14 соответственно. Участок LG10 (Chr06) на карте «А268» был перпендикулярен главной диагонали генома «741», что может указывать на возможную инверсию (рис. ). Важно отметить, что сборка генома была построена на основе данных последовательности «741».

Обсуждение

Целью данного исследования было создание набора эталонных карт генетического сцепления для макадамии с плотностью маркеров, подходящей для построения набора хромосом. Для этой преимущественно ауткроссирующей многолетней древесной культуры мы использовали четыре сегрегирующие популяции, чтобы построить серию карт сцепления, которые максимально использовали модели сегрегации псевдо-тестового скрещивания, доступные в потомстве с полными сибсами, двумя родителями и самоопылением. Результат этого комбинированного анализа сцепления способствовал созданию согласованной физической карты.Все созданные карты сцепления имели 14 групп сцепления, соответствующих числу гаплоидных хромосом Macadamia 3 . Создание интегрированных карт сортов из нескольких карт родительского сцепления увеличило плотность маркеров по сравнению с картами компонентов. В целом, комбинация карт сцепления и псевдохромосомных наборов, представленных здесь, представляет собой значительный прогресс в генетике и геномике макадамии.

Преимущества множественных популяций для картирования генетического сцепления

Для получения точной информации, отвечающей требованиям селекции признаков с помощью маркеров и закрепления генома, современные карты сцепления требуют высокой плотности маркеров для увеличения разрешения карты и статистической поддержки порядка маркеров 35 .Традиционно картирование сцепления использовало преимущество отслеживания сегрегации аллелей от родителей, которые расходятся по определенному фенотипу или признаку. Однако ограничение этого упражнения только двумя родителями часто ограничивает генетическую (аллельную) изменчивость и доступные информативные маркеры, что затрудняет получение карт генетического сцепления высокой плотности 36 . Хотя ожидается, что большие размеры популяции увеличат число обнаруживаемых событий рекомбинации, использование нескольких популяций с разным происхождением может увеличить количество обнаруженных маркеров и плотность карт 13 .

Ценность включения нескольких популяций в картографические проекты для определения аллельного разнообразия и увеличения представленности рекомбинации была признана и продемонстрирована как для инбридинговых видов, таких как Arabidopsis 37 , так и для риса

38 , 90 3 , а также культуры ауткроссинга, включая яблоню 40 , 41 , клубнику 42 и персик 13 .Это включает в себя многородительские смешанные популяции Advanced Generation Intercross (MAGIC), которые были разработаны для ряда инбридинговых культур, таких как томат 43 , пшеница 44 и сорго 45 с целью увеличения генетического разнообразия. и пробовать дополнительные события рекомбинации и впоследствии улучшать разрешение карты.

Относительно небольшие размеры популяции, использованные в этом исследовании (n = 35–116), ограничивали количество СО, обнаруженных для каждой популяции.Однако включение трех двухродительских популяций с разными наборами информативных маркеров увеличило общее аллельное разнообразие в наборе данных, тем самым увеличив плотность маркеров и охват генома.

Сильное соответствие между составными картами привело к успешной интеграции карт в другие исследования 46 48 . Объединение информации со всех шести родительских карт и собственной карты «741» дало достаточно высокий уровень конгруэнтности (ρ = 0,90, p < 0.01), чтобы можно было создавать интегрированные карты. Высокая частота (> 80%) общих маркеров между родительскими картами позволила интегрировать карты, увеличив плотность маркеров на 63% и 78% в интегрированных картах «741» и «A268» по сравнению с отдельными картами. Это согласуется с предыдущими исследованиями, которые показали, что интегрированные карты, созданные из нескольких популяций, могут обеспечить более высокую плотность маркеров и, следовательно, больший охват генома по сравнению с отдельными картами 13 , 49 .

Частота кроссинговера и рекомбинация варьировались между картами

Расхождения между картами сцепления, включая длину и частоту кроссинговера, могут отражать различия в скорости рекомбинации 50 , 51 , которые были обнаружены вдоль хромосом у многих видов растений 9090 9090 52 , 53 . Установлено, что вариабельность в распределении СО по хромосомам возникает из-за ряда факторов, включая распределение мобильных элементов, метилирование ДНК и гистоновые метки, гетерозиготность, одомашнивание, окружающую среду, возраст, пол и инфицирование патогеном 54 58 .

Макадамия предпочтительно подвергается ауткроссингу, но были сообщения о значительных различиях в показателях самоопыления между сортами 7 , 59 61 . Сорт «741» является относительно самофертильным, и проверка на отцовство потомства, использованного в этом исследовании, выявила самооплодотворенное потомство (3,3–5,6%) от контролируемых скрещиваний, где «741» был родителем женского пола, но не там, где «А268» был самкой. родитель (Таблица S1 ). Материнские карты, полученные из «741», имели более высокую долю потомства в каждой группе сцепления, где не было обнаружено СО, по сравнению с материнской картой «А268», в то время как у самцов наблюдается обратное (рис.). Это говорит о том, что различия в системах спаривания родительских сортов, используемых в этом исследовании, могли способствовать наблюдаемому изменению скорости рекомбинации. Система спаривания (самоопыление или ауткроссинг) связана с изменением скорости рекомбинации, при этом самоопыление приводит к более низкой степени эффективной рекомбинации 62 , а полиморфизм мобильных элементов выше в популяциях самоопыления, как у A. lyrata 63 . Различия в скорости рекомбинации между собственными и ауткроссинговыми видами были зарегистрированы у некоторых видов сельскохозяйственных культур, включая помидоры 64 и грибы 65 , 66 .

Также известно, что на распределение гаметических CO влияет вариация гетерозиготности, при этом частота локализованной рекомбинации зависит от факторов, включая структуру хроматина и механизмы репарации 54 . Подавление рекомбинации также может наблюдаться в результате гетерозиготного состояния в цис с различным гомологическим полиморфизмом, формирующим мейотическую рекомбинацию 67 69 . Сообщается, что гетерозиготность сортов макадамии и диких образцов высока 22 , 70 74 .В этом исследовании у родительских генотипов наблюдалась гетерозиготность 0,18 («741», «А268») и 0,16 («А4»). Хотя это было сопоставимо с предыдущими отчетами, также основанными на кодоминантных данных DArT для размножающихся популяций макадамии 19 , 30 , это значительно ниже, чем оценки на основе SNP для других фруктовых культур, включая оливки (0,44), яблоки (0,36). и персиковый (0,28) 75 77 . Для макадамии относительно низкий уровень гетерозиготности, обнаруженный в этом исследовании, может отражать узкое место в недавнем одомашнивании 78 .Основываясь на данных случайно амплифицированных маркеров RAMiFi, сообщалось, что гетерозиготность у гавайских сортов ниже, чем у гибридных сортов макадамии 27 . Интересно, что наши результаты, основанные на 5793 (‘741’), 4727 (‘A4’) и 4867 (‘A268’) SNP-маркерах, за исключением маркеров с отсутствующими данными, показали небольшую разницу в гетерозиготности между гавайским ‘741’ и австралийским ‘A268’. ‘ и гибридные сорта ‘А4’.

Картографические популяции, использованные в этом исследовании, включали три разных родительских сорта («741», «А268» и «А4»), причем популяции были созданы в результате различных скрещиваний этих сортов.Сгенерированные карты обеспечивают диапазон различных длин карт и частот CO, в зависимости от пересечения. В целом карты, полученные из генотипа M. integrifolia ‘741’, были относительно согласованными. Например, пропорция искаженных маркеров и частоты CO были одинаковыми на трех родительских картах «741». Точно так же карты «741» неизменно короче, чем родительские карты гибридных видов «A268» и «A4», независимо от того, была ли карта получена в результате материнской или отцовской сегрегации.

Напротив, большая изменчивость в длине карты, частоте CO и искажении маркера была обнаружена в родительских картах гибридных сортов. Длина карты была относительно больше для материнской (3662,05 сМ, 1701 маркер) и отцовской (1261,7 сМ, 1797 маркеров) карт «A268». Точно так же мужская карта «А4» была длиннее, чем соответствующая карта «741», полученная из того же скрещивания. Это может указывать на то, что различия в генетическом фоне могут способствовать различиям между картами. У винограда вариации скорости рекомбинации были обнаружены на основе скрещиваний с использованием ряда родителей, межвидовых скрещиваний и популяции F1, полученной от двух родителей-полусибсов 79 .Точно так же различия в скорости рекомбинации, связанные с разными родителями Eucalytptus , оказались статистически значимыми 80 .

Обе родительские карты из скрещивания «A268» x «741» имели относительно высокую частоту по крайней мере двух явных СО на группу сцепления по сравнению с другими скрещиваниями. Мы также заметили, что карты, полученные в результате скрещиваний с участием гибридных генотипов (‘A268’ и ‘A4’), имели более высокий уровень кластеризации маркеров с меньшим количеством уникальных позиций маркеров (таблица).Это может указывать на присутствие маркеров косегрегации и приводить к неточностям в подсчете CO 81 .

Сорт «741» представляет собой M. integrifolia , а «A268» и «A4» являются гибридами M. integrifolia и M. tetraphylla . Сообщается, что эти виды имеют перекрывающееся естественное распространение примерно на 80 км в субтропических тропических лесах восточной Австралии 22 и легко гибридизуются как в естественных, так и в домашних условиях, что указывает на отсутствие генетических барьеров для гибридизации.Хотя возможно, что гибридная природа «A268» и «A4» может способствовать относительно большей длине карты и наблюдаемым CO, необходимы дальнейшие исследования, чтобы сформулировать более убедительное понимание вклада различий родительских генотипов в рекомбинацию наследуемых признаков. в макадамии.

Различия в длине карты и частоте CO между картами также могут быть результатом ошибки генотипирования, и это может способствовать относительно более высокому уровню наблюдаемых двойных рекомбинантов, обнаруженных на материнской карте «A268».Были предприняты обширные меры для исключения ошибочных маркеров, однако были обнаружены менделевские несоответствия, которые указывают на ошибку генотипирования в предварительно отфильтрованном наборе данных (таблица S2 ). Имеются доказательства того, что подходы секвенирования генома с уменьшенным представительством, такие как DArT, основанные на рестрикционном расщеплении, могут недооценивать генетическое разнообразие из-за выпадения аллелей (когда один или несколько аллелей не типизированы) и нулевых аллелей 82 85 . Предполагается, что выпадение аллелей будет увеличиваться в гетерозиготных таксонах, поскольку оно связано с полиморфизмом в сайтах рестрикции 86 .

Отчетливые области искажения сегрегации, обнаруженные на собственной карте «741»

Очевидная SD может появиться из-за экспериментальных факторов, таких как ошибка выборки, отсутствующие данные и ошибки генотипирования. И наоборот, это может отражать фактические биологические факторы, такие как конкуренция гамет, несовместимость гибридов, вредные аллели (генетическая нагрузка), отбор и даже потеря или перестройка хромосом 87 89 . При достаточной плотности маркеров SD биологического происхождения с большей вероятностью будет обнаруживаться как кластеры или градиенты маркеров, имеющих сходное поведение в хромосомном регионе.

Маркеры, демонстрирующие искажения, зафиксированы на ряде культур 90 , 91 . Маркеры, отображающие SD, могут быть полезны при картировании QTL 92 , поскольку они часто связаны с генами-кандидатами для определенных признаков. Например, было обнаружено, что области SD у черешни, где 8% маркеров показали искажение, связаны с горячими точками, содержащими признаки плода и времени цветения, а также локус модификатора самонесовместимости 93 .У хлопка несколько важных агрономических признаков были зарегистрированы на хромосоме 18, где 34% маркеров показали искажение 90 .

На собственной карте «741» мы обнаружили, что многие маркеры, отображающие SD, сгруппированы в семь отдельных областей (рис. ). Доля маркеров с SD (16%) соответствовала предыдущим картам генетического сцепления макадамии (16 и 20%). Мир, и др. . 18 выявили SD в четырех регионах по сравнению с семью в шести группах сцепления в текущем исследовании. Они также сообщили о более высокой доле искаженных маркеров у гибридного сорта «А16» по сравнению с M. integrifolia сорта «246». Точно так же в нашем исследовании была обнаружена более высокая доля искаженных маркеров, когда «A268» был родителем женского пола. Относительно более высокие уровни искаженных маркеров в собственной карте «741» и материнской карте «A268» могут указывать на отбор против вредных локусов.Для областей внутри некоторых псевдохромосом, по-видимому, могут быть доказательства специфичных для гамет асимметрии в SD.

Закрепление генома

Мы создали первые карты сцепления на основе последовательностей для макадамии. По сравнению с отдельными картами комбинация генетических карт, созданных из разных картирующих популяций, улучшила долю закрепленной сборки последовательности генома (таблица). Высокая согласованность между картами и их эффективность в закреплении каркасов генома являются сильными показателями надежности карт.Точное закрепление последовательностей каркаса генома для создания сборок псевдохромосом требует высокого качества как последовательностей каркаса, так и карт генетического сцепления. Все маркеры (4266), которые были сопоставлены по крайней мере с одной из девяти карт генетического сцепления, были сопоставлены с помощью BLASTn с каркасами генома макадамии v2. Из них 83% были сопоставлены с одним каркасом и 12% — с двумя местоположениями, а остальные (5%) — с несколькими каркасами (рис. ). Эти результаты согласуются с недавним исследованием с использованием того же проекта генома, где 80% SNP картированы на одном каркасе 19 .

Метод упорядочения каркасов ALLMAPS максимизирует коллинеарность для создания сборок, которые согласуются с несколькими картами 34 и использовался для закрепления сборок генома с использованием карт сцепления для ряда культур, включая стручковый перец, огурец, просо лисохвост и какао 95 97 . Карты генетического сцепления, разработанные в этом исследовании, закрепили 1465 каркасов, покрывающих 69,7% сборки генома макадамии. Это облегчило создание 14 наборов хромосомных последовательностей общей длиной 519.3 Мбит/с и анкеровка 85% каркасов N50. Ориентация лесов требует не менее двух маркеров на каркас. Из 1465 каркасов, закрепленных на консенсусной физической карте, 58% содержали ≥2 маркеров, включая все каркасы длиной более 1 Мбп.

Как и ожидалось, конгруэнтность порядка маркеров была в целом высокой между каждой из собственных и родительских карт и согласованной физической картой. Однако относительно более низкая конгруэнтность (0,89, 0,82) между консенсусом и картами, полученными из популяции «A268» x «741», может указывать на локальные структурные вариации в геноме «A268» (таблица, рис.). Возможно, что структурные вариации среди геномов родителей картируемых популяций, использованных в этом исследовании, способствовали вариациям в скорости рекомбинации между потомками разных популяций, как это произошло у Arabidopsis 98 , банана 99 и хлопок 100 .

Потенциальные хромосомные перестройки, специфичные для генома

Использование маркеров на основе последовательностей для сравнения генетических карт различных генотипов с физической последовательностью генома может предоставить информацию о потенциальных хромосомных перестройках и более мелких структурных вариациях .Наблюдаемые различия в данных рекомбинации между интегрированными картами «741» и «A268» относительно сборки генома «741» указывают на структурные перестройки в «A268». Особо следует отметить область в верхней части Chr06 (LG10), где участок карты «A268» образует почти перпендикулярную линию от диагонали генома, что указывает на возможную конечную инверсию на Chr06 (рис. ).

Оценки генетической дистанции внутри видового комплекса макадамии на основе SSR указывают на историческое разделение между M.integrifolia и Генофонды M. tetraphylla 26 , 72 . Однако в настоящее время нет оценок вероятного времени этого расхождения. Компания Peace 27 провела самый обширный на сегодняшний день генетический анализ, в который были включены представители всех четырех видов Macadamia и отраслевых сортов с использованием случайно амплифицированных маркеров. Из всех сортов макадамии, выращиваемых в Австралии, наибольшая доля M. tetraphylla была зарегистрирована в «A268», что соответствует межвидовому гибриду F1.Генотип другого гибридного сорта ‘A4’, включенного в это исследование, согласуется с заявленным его происхождением и указывает, что ‘A4’ содержал приблизительно 25% M. tetraphylla 27 . Гибридизация и различия в соответствующем составе генома родительских сортов, используемых в этом исследовании, могут лежать в основе наблюдаемых вариаций в структуре генома и скорости рекомбинации между «741», M. integrifolia (100%) и гибридами: «A268», M. integrifolia (50%) x tetraphylla (50%) и «A4» с родителями «Собственный выбор», M.integrifolia (100%) x «Известность», M. integrifolia (50%) x M. tetraphylla (50%).

Ссылки

1. Christenhusz MJ, Byng JW. Количество известных видов растений в мире и его ежегодный прирост. Фитотаксоны. 2016; 261:201–217. doi: 10.11646/phytotaxa.261.3.1. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]2. Нок С.Дж. и др. Секвенирование генома и транскриптома характеризует генное пространство геномики ВМС Macadamia integrifolia (Proteaceae). 2016;17:937. doi: 10.1186/s12864-016-3272-3.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Рамзи Х. Числа хромосом у Proteaceae. Австралийский журнал ботаники. 1963; 11: 1–20. doi: 10.1071/BT9630001. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]4. Стейс Х.М., Дуглас А.В., Сэмпсон Дж.Ф. Действительно ли у Proteaceae была «палеополиплоидия»? Австралийская систематическая ботаника. 1998; 11: 613–629. doi: 10.1071/SB98013. [CrossRef] [Google Scholar]

5. Стивенсон, Р. А. Селекция, селекция и разработка новых сортов макадамии для австралийской промышленности .(Корпорация садоводческих исследований и разработок, 1996 г.).

6. Седжли М. Рост пыльцевых трубок макадамии. Садоводческая наука. 1983; 18: 333–341. doi: 10.1016/0304-4238(83)

-8. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 7. Лэнгдон К.С., Кинг Г.Дж., Нок К.Дж. Анализ ДНК на отцовство указывает на неожиданно высокий уровень самооплодотворения у макадамии. Генетика деревьев и геномы. 2019;15:29. doi: 10.1007/s11295-019-1336-7. [CrossRef] [Google Scholar]

9. Топп Б.Л., Нок С.Дж., Харднер К.М., Алам М.М. и О’Коннор, К. М. Макадамия (Macadamia spp.) Разведение. Достижения в области стратегий селекции растений 221–251 (Springer, 2019).

10. Делам М. и соавт. Интрогрессия изменяет распределение рекомбинации у межвидовых гибридов виноградной лозы. Теоретическая и прикладная генетика. 2019;132:1073–1087. doi: 10.1007/s00122-018-3260-x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Первый JL. Использование карт сцепления для исправления и формирования сборок генома de novo: методы, проблемы и вычислительные инструменты.Границы в генетике. 2015;6:220. doi: 10.3389/fgene.2015.00220. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Вайхо К. и др. Карты генетического сцепления с высокой плотностью дают новое представление о системе определения пола ZW / ZZ и характеристиках роста грязевых крабов (Scylla paramamosain) Frontiers в генетике. 2019;10:298. doi: 10.3389/fgene.2019.00298. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15. Мэн Л., Ли Х., Чжан Л., Ван Дж. QTL IciMapping: Интегрированное программное обеспечение для построения карты генетического сцепления и количественного картирования локуса признака в популяциях с двумя родителями.Журнал урожая. 2015;3:269–283. doi: 10.1016/j.cj.2015.01.001. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 17. Тянь М. и др. Построение генетической карты высокой плотности и картирование локуса количественных признаков у морского огурца Apostichopus japonicus. Научные отчеты. 2015;5:14852. doi: 10.1038/srep14852. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Peace CP, Vithanage V, Turnbull CG, Carroll BJ. Генетическая карта макадамии на основе случайно амплифицированных маркеров фингерпринтинга ДНК (RAF). Эвфитика.2003; 134:17–26. doi: 10.1023/A:10261568. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 19. О’Коннор К. и др. Структура популяции, генетическое разнообразие и неравновесие по сцеплению в размножающейся популяции макадамии с использованием маркеров SNP и silicoDArT. Генетика деревьев и геномы. 2019;15:24. doi: 10.1007/s11295-019-1331-z. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 20. Ван Дж. и др. Интеграция карт сцепления для амфидиплоида Brassica napus и сравнительного картирования с Arabidopsis и Brassica rapa. Геномика ВМС. 2011;12:1.дои: 10.1186/1471-2164-12-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

21. Коллинз, А. Проблема сборки последовательности генома. Открытый журнал биоинформатики 11 (2018).

22. Hardner, C.M. и др. . Генетические ресурсы и одомашнивание макадамии. Садоводческие обзоры 35 (2009).

23. О’Фаррелл, П., Ле Лагадек, Д. и Сирл, К. В XXIX Международный садоводческий конгресс по садоводству: поддержание жизни, средств к существованию и ландшафтов (IHC2014) : 1109.143–150.

24. Харднер К. Одомашнивание макадамии на Гавайях. Генетические ресурсы и эволюция сельскохозяйственных культур. 2016;63:1411–1430. doi: 10.1007/s10722-015-0328-1. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 25. Peace C, Allan P, Vithanage V, Turnbull C, Carroll B. Генетические отношения между сортами макадамии, выращиваемыми в Южной Африке, по оценке маркеров RAF. Южноафриканский журнал растений и почвы. 2005; 22:71–75. doi: 10.1080/02571862.2005.10634684. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 26. Nock, CJ и др. . Последовательности дробовика полного генома для обнаружения и применения микросателлитов в культивируемых и диких макадамиях (Proteaceae). Применение в науках о растениях 2 (2014). [Бесплатная статья PMC] [PubMed]

27. Peace, CP Генетическая характеристика макадамии с ДНК-маркерами. (доктор философии) Университет Квинсленда. Сент-Люсия,. Австралия (2002 г.).

28. Килиан, А. и др. . Технология массивов разнообразия: общая технология профилирования генома на открытых платформах. Производство и анализ данных в популяционной геномике: методы и протоколы , 67–89 (2012). [В паблике] 29. Барилли Э. и др. Интегрированная генетическая карта высокой плотности на основе SNP DArTseq Pisum fulvum и идентификация QTL, контролирующих устойчивость к ржавчине.Границы в науке о растениях. 2018;9:167. doi: 10.3389/fpls.2018.00167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]30. Алам М., Нил Дж., О’Коннор К., Килиан А., Топп Б. Сверхвысокопроизводительные маркеры silicoDArT и SNP на основе DArTseq для геномных исследований макадамии. ПлоС один. 2018;13:e0203465. doi: 10.1371/journal.pone.0203465. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Янсен Дж., Де Йонг А., Ван Оойен Дж. Построение плотных карт генетического сцепления. Теоретическая и прикладная генетика.2001; 102:1113–1122. doi: 10.1007/s001220000489. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 32. Стэм П. Построение интегрированных карт генетического сцепления с помощью нового компьютерного пакета: Join Map. Журнал завода. 1993; 3: 739–744. doi: 10.1111/j.1365-313X.1993.00739.x. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 33. Voorrips R. MapChart: программное обеспечение для графического представления карт сцепления и QTL. Журнал наследственности. 2002; 93:77–78. doi: 10.1093/jhered/93.1.77. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Гутьеррес-Гонсалес Дж.Дж., Машер М., Поланд Дж., Мюльбауэр Г.Дж.Плотные карты сцепления генотипа путем секвенирования двух эталонных синтетических популяций W7984× Opata дают представление о структурном разнообразии пшеницы. Научные отчеты. 2019;9:1793. doi: 10.1038/s41598-018-38111-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]36. Ху Дж. и др. Генетические свойства гнездовой ассоциации, картирующей популяцию, построенную из полуозимого и ярового рапса. Границы науки о растениях. 2018;9:1740. doi: 10.3389/fpls.2018.01740. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]37.Хуан Х и др. Анализ естественной аллельной изменчивости арабидопсиса с использованием популяции рекомбинантных инбредных линий от нескольких родителей. Труды Национальной академии наук. 2011; 108:4488–4493. doi: 10.1073/pnas.1100465108. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]38. Бандильо Н. и др. Многородительские популяции скрещивания продвинутого поколения (MAGIC) риса: прогресс и потенциал для генетических исследований и селекции. Рис. 2013;6:11. doi: 10.1186/1939-8433-6-11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]39.Рагхаван С. и др. Подходы к характеристике генетической структуры и картированию многородственной популяции риса. G3: Гены, Геномы . Генетика. 2017;7:1721–1730. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]40. Хан М.А., Хан Ю., Чжао Ю.Ф., Троджио М., Корбан С.С. Консенсусная генетическая карта нескольких популяций обнаруживает непостоянный порядок маркеров среди карт, который, вероятно, объясняется структурными вариациями в геноме яблони. ПлоС один. 2012;7:e47864. doi: 10.1371/journal.pone.0047864. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41.Ндиай А. и др. Построение интегрированной консенсусной карты генома яблони на основе четырех картографических популяций. Генетика деревьев и геномы. 2008; 4: 727–743. doi: 10.1007/s11295-008-0146-0. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 42. Манганди Дж. и др. Родословный анализ многородственной популяции октоплоидной земляники выявил аллели QTL, придающие устойчивость к Phytophthora cactorum. G3: Гены, геномы, генетика. 2017; 7: 1707–1719. doi: 10.1534/g3.117.042119. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43.Паскуаль Л. и др. Потенциал популяции томатов MAGIC для расшифровки генетического контроля над количественными признаками и обнаружения причинных вариантов в эпоху повторного секвенирования. Журнал биотехнологии растений. 2015;13:565–577. doi: 10.1111/pbi.12282. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Stadlmeier M, Hartl L, Mohler V. Полезность смешанной популяции продвинутого поколения от нескольких родителей со значительно сокращенным дизайном спаривания для генетических исследований озимой пшеницы. Границы науки о растениях. 2018;9:1825. дои: 10.3389/fpls.2018.01825. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Онгом П.О., Эджета Г. Дизайн спаривания и генетическая структура смешанной (волшебной) популяции сорго (Sorghum bicolor (L.) Moench) с несколькими родителями передового поколения. G3: Гены, геномы, генетика. 2018; 8: 331–341. doi: 10.1534/g3.117.300248. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Бали С. и др. Построение карты генетического сцепления и картирование признака засухоустойчивости индийского чая. Молекулярная селекция.2015;35:112. doi: 10.1007/s11032-015-0306-5. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 47. Батлер Дж. и др. Сравнительная геномика эвкалипта и коримбии выявляет низкую скорость структурной перестройки генома. Геномика ВМС. 2017;18:397. doi: 10.1186/s12864-017-3782-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48. Атес Д. и соавт. Консенсусная карта сцепления чечевицы на основе маркеров DArT из трех картирующих популяций RIL. ПлоС один. 2018;13:e01. doi: 10.1371/journal.pone.01. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49.Ди Пьерро Э.А. и др. Генетическая карта SNP с высокой плотностью от нескольких родителей на яблоне подтверждает новый подход к картированию для ауткроссинга видов. Исследования в области садоводства. 2016;3:16057. doi: 10.1038/hortres.2016.57. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Лэмбинг С., Франклин Ф.Ч., Ван С.-Дж.Р. Понимание и управление мейотической рекомбинацией у растений. Физиология растений. 2017;173:1530–1542. doi: 10.1104/стр.16.01530. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Конг А. и др. Мелкомасштабные различия в скорости рекомбинации между полами, популяциями и отдельными людьми.Природа. 2010;467:1099. doi: 10.1038/nature09525. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

53. Mezard, C. (Portland Press Limited, 2006).

54. Stapley J, Feulner PG, Johnston SE, Santure AW, Smadja CM. Различия в частоте и распределении рекомбинации у эукариот: закономерности и процессы. Фил. Транс. Р. Соц. Б. 2017; 372:20160455. doi: 10.1098/rstb.2016.0455. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Хендерсон ИР. Контроль частоты мейотической рекомбинации в геномах растений.Современное мнение в биологии растений. 2012; 15: 556–561. doi: 10.1016/j.pbi.2012.09.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Драйссиг С., Машер М. и Хекманн С. Изменение скорости рекомбинации обусловлено одомашниванием ячменя и условиями окружающей среды. Молекулярная биология и эволюция (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed]57. Хиггинс Д.Д., Осман К., Джонс Г.Х., Франклин Ф.Ч. Факторы, лежащие в основе ограниченной локализации кроссинговера в мейозе ячменя. Ежегодный обзор генетики. 2014;48:29–47.doi: 10.1146/annurev-genet-120213-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Филлипс Д. и соавт. Влияние температуры на мужской и женский рекомбинационный ландшафт ячменя. Новый фитолог. 2015; 208:421–429. doi: 10.1111/nph.13548. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

59. Vithanage, V., McConchie, C.A. & Meyers, N. Максимизация преимуществ перекрестного опыления в садах макадамии: итоговый отчет . (Садоводство Австралии, 2002 г.).

60. МакКончи, К.А., Мейерс, Н., Витанадж, Х. и Тернбулл, К. Влияние родительской пыльцы на качество орехов и урожай макадамии (1997).

61. Уоллес Х., Витанадж В., Эксли Э. Влияние дополнительного опыления на набор орехов макадамии (Proteaceae) Annals of Botany. 1996; 78: 765–773. doi: 10.1006/anbo.1996.0187. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 63. Бончев Г., Вилли Ю. Накопление мобильных элементов в самоопыляющихся популяциях Arabidopsis lyrata подтверждает модель эктопической рекомбинации эволюции транспозонов.Новый фитолог. 2018; 219:767–778. doi: 10.1111/nph.15201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]64. Бодри Э., Кердельхью С., Иннан Х., Стефан В. Влияние видов и рекомбинации на изменчивость ДНК рода томатов. Генетика. 2001; 158: 1725–1735. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]65. Du X-H, Zhao Q, Xu J, Yang ZL. Высокий уровень инбридинга, ограниченная рекомбинация и расходящиеся эволюционные модели между двумя симпатрическими видами сморчков в Китае. Научные отчеты. 2016;6:22434. doi: 10.1038/srep22434.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]66. Зонненберг А.С. и соавт. Подробный анализ рекомбинационного ландшафта шампиньона Agaricus bisporus var. биспор. Генетика и биология грибов. 2016;93:35–45. doi: 10.1016/j.fgb.2016.06.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]67. Циолковский П.А. и соавт. Совмещение гетерозиготных и гомозиготных областей вызывает ремоделирование реципрокного кроссовера посредством интерференции во время мейоза арабидопсиса. электронная жизнь. 2015;4:e03708. doi: 10.7554/eLife.03708. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]68. Охта Т. Заметка о корреляции между гетерозиготностью и скоростью рекомбинации. Гены и генетические системы. 1999; 74: 209–210. doi: 10.1266/ggs.74.209. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]69. Длужевская Дж., Шиманская М. и Зиолковски П. А. Где перейти? Определение сайтов кроссинговера у растений. Границы генетики 9 (2018). [Бесплатная статья PMC] [PubMed]70. Арадья М.К., Йи Л.К., Зи Ф.Т., Маншардт Р.М. Генетическая изменчивость макадамии.Генетические ресурсы и эволюция сельскохозяйственных культур. 1998; 45:19–32. doi: 10.1023/A:1008634103954. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 71. Нок С.Дж., Батен А., Кинг Г.Дж. Полный хлоропластный геном Macadamia integrifolia подтверждает позицию гондванского семейства эвдикотовых Proteaceae, расходящихся рано. Геномика ВМС. 2014;15:1. doi: 10.1186/1471-2164-15-S9-S13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]72. О’Коннор К., Пауэлл М., Нок С., Шэпкотт А. Урожай к дикому потоку генов и генетическому разнообразию уязвимых видов макадамии (Proteaceae) в Новом Южном Уэльсе, Австралия.Биологическая консервация. 2015;191:504–511. doi: 10.1016/j.biocon.2015.08.001. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 73. Испания C, Лоу А. Генетические последствия фрагментации субтропических тропических лесов для Macadamia tetraphylla (Proteaceae) Silvae Genetica. 2011;60:241–249. doi: 10.1515/sg-2011-0032. [CrossRef] [Google Scholar] 74. Шмидт А., Скотт Л., Лоу А. Выделение и характеристика микросателлитных локусов из макадамии. Заметки по молекулярной экологии. 2006; 6: 1060–1063. doi: 10.1111/j.1471-8286.2006.01434.x. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 75.Антанавичюте Л. и соавт. Разработка плотной карты сцепления на основе SNP потомства подвоя яблони с использованием массива генотипирования всего генома Malus Infinium. Геномика ВМС. 2012;13:203. дои: 10.1186/1471-2164-13-203. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]76. Реале С. и др. Маркеры на основе SNP для различения сортов маслины (Olea europaea L.). Геном. 2006;49:1193–1205. doi: 10.1139/g06-068. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]77. Мичелетти Д. и соавт. Полногеномный анализ разнообразия и ассоциации основных генов SNP в зародышевой плазме персика.ПлоС один. 2015;10:e0136803. doi: 10.1371/journal.pone.0136803. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]78. Nock, CJ и др. . Дикое происхождение одомашнивания макадамии установлено с помощью внутривидового секвенирования генома хлоропластов. Frontiers in Plant Science 10 (2019). [Бесплатная статья PMC] [PubMed]79. Лоу К.М., Риаз С., Уокер М.А. Различия в скорости рекомбинации у разных видов Vitis. Генетика деревьев и геномы. 2009; 5:71–80. doi: 10.1007/s11295-008-0187-4.[CrossRef] [Google Scholar]81. Н’Диай А., Хайле Дж. К., Фаулер Д. Б., Аммар К., Позняк С. Дж. Влияние совместного разделения маркеров на генетические карты высокой плотности и прогнозирование расширения карты с использованием алгоритмов машинного обучения. Границы науки о растениях. 2017;8:1434. doi: 10.3389/fpls.2017.01434. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]82. Бресадола Л., Линк В., Бюркле К.А., Лексер К. и Вегманн Д. Оценка и учет ошибок генотипирования в экспериментах RAD-seq. BioRxiv , 587428 (2019).[В паблике] 83. Эндрюс К.Р., Гуд Дж.М., Миллер М.Р., Луикарт Г., Гогенлоэ П.А. Использование возможностей RADseq для экологической и эволюционной геномики. Природа Обзоры Генетика. 2016;17:81. doi: 10.1038/nrg.2015.28. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]84. Кук Т.Ф. и соавт. GBStools: статистический метод оценки выпадения аллелей в данных секвенирования с уменьшенным представлением. Генетика PLoS. 2016;12:e1005631. doi: 10.1371/journal.pgen.1005631. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]85.Arnold B, Corbett-Detig RB, Hartl D, Bomblies K. RAD seq недооценивает разнообразие и вносит генеалогические ошибки из-за неслучайной выборки гаплотипов. Молекулярная экология. 2013;22:3179–3190. doi: 10.1111/mec.12276. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]86. Готье М. и соавт. Влияние выпадения аллеля RAD на оценку генетической изменчивости внутри и между популяциями. Молекулярная экология. 2013;22:3165–3178. doi: 10.1111/mec.12089. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]87. Эдаэ Э.А., Оливера П.Д., Джин И., Роуз М.Н.Генотипирование путем секвенирования облегчает создание согласованной карты сцепления с высокой плотностью для Aegilops umbellulata, дикого родственника культивируемой пшеницы. G3: Гены, геномы, генетика. 2017;7:1551–1561. doi: 10.1534/g3.117.039966. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]88. Боденес, К., Шансерель, Э., Эренманн, Ф., Кремер, А. и Пломион, К. Картирование сцепления с высокой плотностью и распределение областей искажения сегрегации в геноме дуба. Исследование ДНК , dsw001 (2016). [Бесплатная статья PMC] [PubMed]89.Альхейт К.В. и др. Обнаружение локусов искажения сегрегации у тритикале (x Triticosecale Wittmack) на основе консенсусной карты генетического сцепления маркеров DArT высокой плотности. Геномика ВМС. 2011;12:1. дои: 10.1186/1471-2164-12-380. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]90. Дай Б., Го Х., Хуанг С., Ахмед М. М., Лин З. Идентификация и характеристика локусов искажения сегрегации на хромосоме 18 хлопка. Границы в науке о растениях. 2017;7:2037. doi: 10.3389/fpls.2016.02037. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]91.Лю С и др. Прогресс искажения сегрегации в генетическом картировании растений. Рез Джей Агрон. 2010;4:78–83. doi: 10.3923/rjagr.2010.78.83. [CrossRef] [Google Scholar]93. Calle A, Cai L, Iezzoni A, Wünsch A. Карты сцепления с высокой плотностью, построенные у черешни (Prunus avium L.) с использованием популяций перекрестного и самоопыления, показывают хромосомную гомозиготность в инбредных семьях и несинтенных регионах с геномом персика. . Генетика деревьев и геномы. 2018;14:37. doi: 10.1007/s11295-018-1252-2. [CrossRef] [Google Scholar]

94.Пис, К., Минг, Р., Шмидт, А., Мэннерс, Дж. и Витанадж, В. В Genomics of Tropical Crop Plants 313–332 (Springer, 2008).

96. Tsai KJ, et al. Сборка Setaria italica L. Beauv. генома на девять хромосом и понимание областей, влияющих на рост и устойчивость к засухе. Научные отчеты. 2016;6:35076. doi: 10.1038/srep35076. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]97. Моррисси Дж., Стэк Дж.С., Валлс Р., Мотамайор Дж.С. Недорогая сборка генома урожая какао способна разрешить сложные гетерозиготные пузыри.Исследование садоводства. 2019;6:44. doi: 10.1038/s41438-019-0125-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]98. Qi J, Chen Y, Copenhaver GP, Ma H. Обнаружение геномных вариаций и полиморфизмов ДНК и влияние на анализ мейотической рекомбинации и генетическое картирование. Труды Национальной академии наук. 2014;111:10007–10012. doi: 10.1073/pnas.1321897111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]99. Бауренс Ф.К. и др. Рекомбинация и большие структурные вариации формируют межвидовые геномы съедобных бананов.Молекулярная биология и эволюция. 2018;36:97–111. doi: 10.1093/molbev/msy199. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]100. Ян Зи и др. Обширный внутривидовой порядок генов и структурные вариации генов у сортов горного хлопка. Связь с природой. 2019;10:2989. doi: 10.1038/s41467-019-10820-x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]102. Роджерс-Мельник Э. и соавт. Рекомбинация у разнообразной кукурузы стабильна, предсказуема и связана с генетической нагрузкой. Труды Национальной академии наук.2015;112:3823–3828. doi: 10.1073/pnas.1413864112. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Frontiers | Применение высокопроизводительной масс-цитометрии с визуализацией Hyperion в исследованиях рака

Введение

Рак является ведущей причиной смерти во всем мире в странах с любым уровнем дохода. Ожидается, что число случаев рака и смертей будет быстро увеличиваться в связи с глобальным ростом и старением населения (1). Таким образом, исследования рака остаются глобальной проблемой для лучшего понимания его механизмов и поиска новых терапевтических решений.Прогрессирование рака представляет собой многоэтапный процесс, требующий участия множества гетерогенных компонентов, которые могут взаимодействовать друг с другом (2). Микроокружение опухоли (TME) и взаимодействия между опухолевыми и неопухолевыми иммунными и неиммунными клетками имеют решающее значение для инициации и прогрессирования рака, например, с доставкой внеклеточных сигналов, поддерживающих ангиогенез опухоли и стимулирующих периферическую иммунную толерантность (3). , 4). Прямые клинические применения появились в результате исследований TME, например, прогностических приложений, основанных на количественном определении инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), и терапевтических (и терагностических) приложений с иммунотерапией, ингибирующей иммунные контрольные точки, противораковой иммунотерапией, нацеленной на CTLA-4 и PD-. Оси 1/PD-L1 при различных солидных опухолях (5, 6).

Продолжение более всестороннего исследования гетерогенности и распределения компонентов TME позволит лучше понять противо- и проопухолевые механизмы, происходящие в опухолях, и является ключом к улучшению ведения пациентов с раком для улучшения диагностики, прогностического и терапевтического действия. Приложения. Чтобы расшифровать сложность опухолевой ткани и TME, было разработано несколько методов для получения максимума данных из клеточных материалов, выделенных из опухолевой ткани, а совсем недавно с помощью 91 697 методов in situ 91 698, добавляющих пространственную информацию о взаимодействиях клеток в их пределах. тканевого контекста к фенотипическим данным (7, 8).

Визуализирующая масс-цитометрия (IMC) является одним из этих методов, позволяющим получить всестороннюю характеристику ткани вплоть до уровня отдельных клеток и предлагающим большие возможности расшифровки и корреляции характеристик опухолевой ткани и TME с биологическими и медицинскими данными. В этой статье мы сначала представляем этот метод IMC с технической и практической точки зрения, прежде чем предоставить обзор исследований, посвященных раку, с использованием IMC, и, наконец, мы обсуждаем, как IMC будет интегрироваться в текущие и будущие исследования рака и клинические приложения среди другие обычно доступные более инновационные методы исследования тканей.

Масс-цитометрия с визуализацией Hyperion

® Технология

От цитометрии к масс-цитометрии с визуализацией

Цитометрия и иммуногистохимия/иммунофлуоресценция (ИГХ/ИФ) являются стандартными методами, ежедневно используемыми в диагностических целях для фенотипирования клеток в жидких суспензиях или в образцах тканей соответственно . Оба они используют выделение белковых маркеров в клетках и тканях благодаря антителам (Ab), нацеленным на эпитопы этих белковых маркеров. Антитела соединены с системой выявления, позволяющей обнаруживать и количественно определять антитела, фиксированные в клетках и тканях, отражающие обилие и локализацию целевых белковых маркеров.Тем не менее, количество маркеров, которые можно одновременно анализировать с использованием этих диагностических методов, остается низким из-за небольшого количества каналов выявления, которые можно использовать вместе, что ограничивает количество одновременно используемых антител с различной маркировкой. Действительно, стандартная флуоресцентная цитометрия и методы IF ограничены в своих возможностях мультиплексирования из-за перекрывающихся спектров некоторых флуорохромов, делающих их собственный сигнал неразличимым для другого, и это ограничение требует использования только небольшого количества флуорохромов с неперекрывающимися сигналами в этих спектрах. методы.

Одним из способов увеличения количества одновременно анализируемых маркеров было использование новых систем обнаружения различных антител без перекрытия спектров и сигнала обнаружения. Каждый изотоп металла имеет надлежащую массу, которая позволяет его индивидуальное обнаружение в соответствии с его временем пролета (TOF) с использованием масс-спектрометрии. Таким образом, различные изотопы металлов могут использоваться в качестве систем обнаружения с методами идентификации на основе TOF. Стратегия использования антител с металлическими метками и их обнаружения с помощью масс-спектрометрии впервые была использована для применения в цитометрии благодаря развитию цитометрии методом масс-спектрометрии TOF (CyTOF) (9).Связывание нескольких различных изотопов металлов с разными антителами, нацеленными на несколько белков, и использование масс-спектрометрии для их обнаружения обеспечивает высокие возможности мультиплексирования при количественном определении одновременно различных маркеров. Количество различных доступных изотопов металлов (на сегодняшний день доступно около 50, большинство из которых принадлежит к семейству лантанидов) определяет количество маркеров, которые можно совместно анализировать с помощью этого метода (10). Таким образом, мультиплексирующая способность CyTOF значительно превышает возможности цитометрии на основе флуорохрома.

Сочетание технологии CyTOF с лазерной абляцией клеточного/тканевого материала, уложенного на предметные стекла, привело к методу масс-цитометрии с визуализацией (IMC), добавляющему информацию об архитектуре ткани к данным, основанным на CyTOF. Таким образом, IMC заключалась в значительном прогрессе в способности мультиплексного иммунологического обнаружения нескольких маркеров в образцах тканей (9) с возможностью одновременной оценки до 50 белковых маркеров (с 50 металлизированными антителами) на каждой клетке (10) в пределах ткани, значительно превосходя возможности мультиплексирования IHC/IF.Помимо анализа клеток в их тканевом контексте, разрешение IMC (1 мкм², состоящее из поверхности клетки/ткани, абляции лазером во время каждого отдельного импульса) также позволяет локализовать белки в ядерных, цитоплазматических и мембранных клеточных компартментах. Эта технология IMC была коммерциализирована в 2011 г. корпорацией Fluidigm (Южный Сан-Франциско, Калифорния, США) под названием Hyperion Imaging System, что позволяет теперь применять анализ IMC к любому типу образцов, уложенных на предметные стекла в виде клеток (11), формалин — Фиксированные срезы ткани, залитые парафином (FFPE) (10) или быстрозамороженные ткани (2).Таким образом, IMC особенно подходит для изучения небольших и ценных архивных образцов патологии, таких как биопсии (12). Как и применение IHC/IF, обработка IMC следует тем же этапам предварительной обработки образцов перед инкубацией Ab и промывки перед анализом сигналов Abs в образцах клеток/тканей. Тем не менее, при обработке анализов IMC, как указано ниже, необходимо было принять во внимание некоторые конкретные проблемы. Основные этапы процесса IMC обобщены на рисунке 1.

Рисунок 1 Схематический рабочий процесс метода масс-цитометрии (IMC) с визуализацией Hyperion (Fluidigm) для определения профиля белков.За обработкой образцов и созданием панели антител следует окрашивание IMC и сбор данных, чтобы использовать выходные данные для анализа.

О дизайне панели маркеров и оптимизации иммуномаркировки

Основным условием применения IMC является дизайн панели Abs и оптимизация условий инкубации Abs на образцах. Во-первых, необходимо установить перечень маркеров, изучение которых может помочь решить поставленный биологический и/или клинический вопрос.Затем важно получить антитела, нацеленные на разные маркеры, отвечающие для каждого из них следующим критериям: 1) условия хранения, допускающие связывание с металлом (например, отсутствие среды хранения, содержащей альбумин), если выбранные антитела ранее не связывались. к металлам, 2) хорошее окрашивание, полученное на этапе валидации ИГХ на контрольной ткани, 3) условия предварительной обработки для извлечения антигена во время валидации ИГХ, идентичные условиям для других антител, составляющих панель [например, Трис-ЭДТА pH 9 (13–16) или цитрат pH 6 (17)] с учетом того, что различные антитела необходимо совместно инкубировать в пуле антител на одном и том же предварительно обработанном предметном стекле во время обработки IMC.

Следует отметить, что если IHC может дать надежный предварительный просмотр качества окрашивания для большинства антител (17), проблемы могут возникнуть, в частности, с маркерами с низкой экспрессией, которые заслуживают конъюгации соответствующих антител с изотопами металлов с наиболее сильными индекс обнаружения для оптимизации их дальнейшего обнаружения при анализе ИМК.

Для оптимизации специфического отношения сигнал/шум и улучшения обнаружения маркеров с низкой экспрессией условия инкубации также могут быть адаптированы в зависимости от Ат, используемых для улучшения обнаружения маркеров.Например, циклы инкубации/промывки также можно повторять с разными антителами панели лишь с небольшим увеличением продолжительности этапа окрашивания, но в целом с оптимизацией окрашивания для маркеров с низкой и высокой экспрессией (18). Группа Ijsselsteijn сравнила инкубацию в течение ночи при 4°C или в течение 5 часов при комнатной температуре (17). Как правило, маркеры с низкой экспрессией было труднее оценить, когда их соответствующие антитела инкубировали при 4°C, но их было легче обнаружить при инкубации при комнатной температуре.Напротив, при инкубации при комнатной температуре антитела, предназначенные для высокоэкспрессированных маркеров, часто приводили к более неспецифическому фоновому сигналу, который уменьшался при инкубации при 4°С.

Наконец, в дополнение к валидации каждого антитела по отдельности с использованием ИГХ перед каким-либо связыванием с металлом, также рекомендуется проверять эффективность антител с металлическими метками путем проведения анализа IMC на контрольной ткани, поскольку связывание с металлом может изменить сродство Ab к их эпитопу (2). Действительно, связывание металлов может быть осуществлено благодаря коммерческим наборам, позволяющим разрушить дисульфидные мостики между антителами, чтобы зафиксировать металл внутри белковых молекул антител, и это может модифицировать трехмерную структуру некоторых антител, нарушая их фиксацию к своим мишеням.

После проверки панели антител и оптимизации условий ее инкубации можно проводить эксперимент IMC с объединенными антителами в соответствующих концентрациях.

От слайда к визуализации Масс-цитометрия Изображение

Если мы рассматриваем образец ткани FFPE для анализа с использованием IMC, срезы ткани FFPE, уложенные на предметные стекла, должны быть сначала депарафинированы. После этого предметные стекла предварительно обрабатывают буфером для извлечения антигена (pH6 или pH9, как определено и оптимизировано выше).Затем следует инкубационный период с блокирующим буфером, после чего срезы тканей инкубируют со смесью антител с металлическими метками в оптимальных временных и температурных условиях. После инкубации и промывки интеркалирующий агент ДНК (для контрастного окрашивания ядер) инкубируют, чтобы завершить стадию иммуномечения. Получение Abs-сигналов для их последующего анализа требует использования системы визуализации Hyperion.

Затем цельное иммуномеченое предметное стекло вставляется в камеру для абляции системы визуализации Hyperion.Первый вид камеры позволяет находить и выбирать интересующую область (ROI) на слайде. Эта ROI может быть предварительно выбрана на основе серийно окрашенных срезов ткани или на предметном стекле, используемом для самой IMC, при условии, что метод окрашивания до IMC не ухудшает сам процесс IMC с точки зрения фиксации Abs и получения результатов масс-спектрометрии (2 , 8, 19). Затем выполняется лазерная абляция области интереса, 1 мкм² на 1 мкм². Каждый лазерный импульс удаляет пятно ткани площадью 1 мкм², которое аэрозолируется, распыляется, ионизируется и переносится газообразным гелием в поток аргона с высокой точностью во времени в источник ионов с индуктивно связанной плазмой для сопутствующего анализа с помощью масс-цитометра TOF (CyTOF). инструмент).Затем для каждого пятна ткани каждое изотопное содержание можно сопоставить с исходными координатами. Ткань анализируется точечно, в то время как предметное стекло перемещается под лазером для сканирования всей области интереса (8, 10). Скорость получения составляет около 100 минут на 1 мм² ткани. Каждое пятно аблированной ткани в конечном итоге соответствует пикселю изображения, связанному с содержанием в нем различных ионов металлов. Конечным результатом является многоканальное многопараметрическое изображение (напоминающее изображения, получаемые с помощью флуоресцентных методов) в виде а.mcd, в котором собраны данные о координатах различных пикселей и содержащемся в них металле, что затем позволит оценить интенсивность маркировки и пространственное распределение различных антител, зафиксированных в ткани (9).

От масс-цитометрии к анализу данных

Анализ многоканального изображения IMC может быть выполнен 1) с морфологической точки зрения, как и любое микроскопическое многоканальное флуоресцентное изображение, благодаря средствам просмотра, позволяющим прямую визуализацию.Созданный mcd файл изображения собирает для каждого пикселя изображения его координаты и интенсивности сигналов для различных каналов/изотопов/маркеров металлов (например, средство просмотра MCD, разработанное производителем автомата Hyperion Fluidigm), 2) с биоинформатической точки зрения, требующей выделенных конвейеров. Конвейеры биоинформатики для анализа IMC включают, в частности, удаление шума изображения и сегментацию клеток, что является важным ключом в аналитическом процессе перед экспортом данных отдельных клеток (т.е. координат на изображении и интенсивности многоканального сигнала) для последующего анализа клеток.Сам клеточный анализ состоит в фенотипировании клеток и количественных оценках с помощью подходов, основанных на цитометрии, основанных на фенотипических характеристиках клеток (с использованием стратегий классификации без наблюдения или с учителем), а также в анализе соседства для определения пространственных взаимодействий между клетками в ткани. Доступно несколько бесплатных или коммерческих программ и конвейеров, которые продолжают разрабатываться для проведения анализа данных IMC, как это предлагается в различных исследованиях, кратко изложенных ниже (14, 15, 20–22).И морфологический подход, и анализ биоинформатики предоставляют дополнительные данные при интерпретации данных IMC.

В области рака IMC можно применять к различным подтипам опухолей и образцам для сопоставления данных IMC с различными биологическими или клиническими вопросами, как указано в следующем разделе.

Применение масс-цитометрии с визуализацией в исследованиях, посвященных раку

Патология (гистопатология и цитопатология) заключается в анализе образцов раковой ткани и клеток как для лечения, так и для исследовательских целей.Он подразумевает анализ типов клеток, различных опухолевых и неопухолевых, для получения качественной и количественной информации, коррелирующей с медицинскими и/или биологическими данными. Морфологическая идентификация и анализ клеточных подтипов и взаимодействий дополняются дополнительными качественными и количественными данными. Тем не менее, некоторые ограничения в этих дополнительных исследованиях маркеров связаны, в частности, с 1) потерей подробной пространственной информации о ткани в случае извлечения клеток или клеточного материала (например,ДНК или РНК) из образцов, 2) ограниченные возможности повторения анализа отдельных маркеров на образцах с низким количеством клеток/тканей, подверженных риску истощения, 3) ограниченные возможности одновременного анализа различных маркеров с использованием методов IHC/IF и 4) сложность получения количественных данных по интенсивности сигнала для маркера. IMC позволяет преодолеть эти ограничения за счет 1) хранения морфологической информации о клеточном/тканевом материале, нанесенном на предметные стекла, 2) требующего наличия только одного предметного стекла клеток/ткани, 3) позволяющего проводить совместный анализ до 50 маркеров одновременно и 4) обеспечения не только качественные данные, но и количественную информацию о количестве антител с металлическими метками, зафиксированных в соответствующем месте образца.По этим причинам IMC особенно подходит для углубленного анализа небольшого количества/областей образцов клеток/ткани для корреляции с медицинскими и биологическими данными, как показано ниже.

Описание гетерогенности раковой ткани, клеточных субпопуляций и взаимодействий

Исследование гетерогенности опухолевых тканей и клеток является частым применением IMC, используемым для сообщения подробного состава клеток и клеточных взаимодействий в образце раковой ткани или между различными видами рака. образцов для одного и того же пациента или между группами пациентов (см. сводку в Таблице 1).

Таблица 1 Сводная таблица исследований с использованием технологии ИМК для описания клеточного состава и их взаимодействия в раковой ткани.

Расшифровка сложности структур малых тканей и редких клеток

Среди исследований, посвященных раку с использованием IMC, некоторые были сосредоточены в основном на сообщении о возможности анализа IMC при различных подтипах рака и описании состава различных раковых тканей в качестве технического предварительного шага. перед будущими дополнительными работами по изучению биологических и/или клинических вопросов.Эти технические описательные исследования особенно интересны, поскольку они дополняют другие исследования с использованием IMC для составления отчетов об Abs, которые можно использовать для анализа IMC (2, 20, 23–29). Помимо количественного определения клеточных субпопуляций, эти исследования также указали на возможность количественного определения точных маркеров с использованием IMC в качестве экспрессии PD-L1 при раке легкого и p53 в образцах колоректального рака (26, 28).

IMC, в частности, позволяет проводить углубленное изучение микроскопической структуры ткани в виде третичных лимфоидных структур (TLS) при колоректальном раке или взаимодействия между опухолевыми и иммунными клетками в раковой ткани, содержащей иногда разреженные опухолевые клетки, такие как лимфома Ходжкина, согласно отчету исследования IMC, посвященного к этим двум видам рака Singh et al.которые сообщили соответственно о TLS, богатом Foxp3+ T-клетками, при колоректальном раке и CD8+-T reg и Th3 клетках, окружающих опухолевые клетки при лимфоме Ходжкина (27). Еще одна иллюстрация тонкой расшифровки TME, Ravi et al. подробно описали ткани глиобластом с помощью IMC, и они подтвердили основную роль TME в эволюции опухолей и их гетерогенность с тесной корреляцией между изменениями микроокружения, особенно под влиянием возраста, и отбором конкретных опухолевых субклонов на основе метаболических и геномные особенности (30).

Помимо приложений на основе тканей, IMC также применялся к цитологическим образцам, в которых высокие возможности мультиплексирования IMC позволяют глубоко фенотипировать некоторые редкие клетки, такие как циркулирующие опухолевые клетки, идентифицированные в образцах крови пациентов с такими видами рака, как рак предстательной железы Gerdtsson et al. . (31) или остеосаркома по Batth et al. (32). О применении IMC к линиям раковых клеток с глубоким фенотипом также сообщалось в работе Bouzekri et al. с линиями клеток рака молочной железы. (11).

Описание сложных и новых клеточных фенотипов в раковой ткани

Комбинация маркеров может позволить сообщить о новых клеточных популяциях, как, например, в исследовании Oetjen et al.которые описали новую популяцию CD71+ CD235a+ эритроидных клеток с высокой экспрессией пролиферативного маркера Ki-67, обнаруженного в эритроидных островках в нормальных образцах костного мозга и при миелодиспластическом синдроме (25). Другой пример, Elyada et al. описали при аденокарциноме протоков поджелудочной железы новую популяцию ассоциированных с раком фибробластов (CAF), которые экспрессировали MHC класса II и CD74, но не классические костимулирующие молекулы, и назвали их «антиген-представляющими CAF» (apCAF). Кроме того, было продемонстрировано, что эта популяция способна активировать CD4+ Т-клетки антиген-специфическим образом в модельной системе, подтверждая ее иммуномодулирующую способность (33).При плоскоклеточном раке легкого Li et al. также обнаружили новую субпопуляцию клеток CD3-CD4+ с высоким уровнем TNFa и Foxp3, которые могут модифицировать TME и играть провоспалительную роль (24). Аоки и др. идентифицировали особую субпопуляцию, подобную регуляторным Т-клеткам, с экспрессией гена активации лимфоцитов 3 (LAG3+ Т-клетки) при классической лимфоме Ходжкина, которая не была обнаружена в нормальных реактивных лимфатических узлах (23). Благодаря IMC, аномальные EpCAM+ PD-L1+ CD4+ T-клетки были обнаружены у пациентов с колоректальным раком Zhang et al.IMC также позволил засвидетельствовать, что эти клетки также были CCR5+ и CCR6+ и демонстрировали повышенные уровни фосфорилированных p38 MAPK и MAPKAPK2, что отражает активацию этого сигнального пути (34). Изучая уротелиальные карциномы, Podojil et al. продемонстрировали с помощью IMC экспрессию B7-h5 на субпопуляции миелоидных клеток CD68+ в опухоли, которая может представлять собой альтернативную мишень при раке мочевого пузыря, не отвечающем на фактическое лечение (35).

Описание клеточных взаимодействий в раковой ткани

Помимо обнаружения новых клеточных популяций, IMC позволяет обнаруживать неожиданные пространственные взаимодействия между клетками.При плоскоклеточном раке легкого Xiang et al. обнаружили заметное пространственное взаимодействие между ассоциированными с раком фибробластами (CAF) и моноцитарными миелоидными клетками в TME и, наконец, подчеркнули, что регуляция набора и дифференцировки моноцитов координируется CAF. Они также продемонстрировали, что иммуносупрессивное микроокружение, опосредованное CAF, может быть обращено вспять путем ингибирования CCR2 и элиминации АФК (36).

Сравнение различных образцов рака, гистопатологических и клинических подтипов

Сравнение различных образцов рака у одного и того же пациента может помочь лучше понять механизм его прогрессирования.Например, исследование IMC клеток в образцах предстательной железы и костного мозга у пациентов с метастатическими аденокарциномами предстательной железы было проведено Малихи и соавт., которые не только подтвердили сохраняющуюся линию эпителиальных клеток просвета предстательной железы опухолевых клеток между образцами посредством коэкспрессии EpCAM, PSA и PMSA, но также продемонстрировали, что уровень экспрессии рецептора андрогена был выше в метастатических опухолевых клетках, чем в простатических (37).

Сравнение различных подтипов рака, поражающих один и тот же орган, но имеющих различный прогноз и ответ на лечение, также может быть достигнуто с помощью анализа IMC.Например, TME светлоклеточной карциномы яичника, как было описано Cun et al., отличается от таковой для серозных опухолей яичников высокой степени злокачественности. с заметными признаками, связанными с плохим прогнозом (меньше внутриопухолевых CD8+ Т-клеток, более высокая плотность раковых клеток B7-h5 high Ki67 high и более высокая плотность клеток CD73 high ) (38).

Напротив, сравнение идентичных подтипов рака у пациентов с разными клиническими состояниями также является потенциальным вопросом, который можно решить с помощью анализа IMC, поскольку исследование Yusuf et al.сравнение TME немелкоклеточного рака легкого у пациентов с ВИЧ-инфекцией и без нее и указание различий в более выраженной экспрессии PD-L1 клетками CD68 у ВИЧ-положительных пациентов среди других различий в отношении MHC класса I и II и маркеров пролиферации (39).

Корреляция данных IMC с прогнозом пациента и реакцией на лечение

Корреляция данных IMC с клиническими и биологическими данными об эволюции рака и ответе на противораковое лечение может не только улучшить понимание различных раковых заболеваний, но также может указать некоторые новые биомаркеры, помогающие для прогнозирования эволюции рака и его реакции на лечение.Исследования с использованием IMC на образцах человека в корреляции с этими клиническими данными обобщены в таблице 2.

Таблица 2 Сводная таблица исследований прогноза пациентов и результатов лечения с использованием технологии IMC в раковых тканях человека и мыши.

Поиск прогностических биомаркеров в области ингибирования противораковых иммунных контрольных точек

В эпоху быстрого роста применения противораковых иммунных контрольных точек, ингибирующих иммунотерапию (ICI), в нескольких исследованиях использовалась IMC, пытающаяся найти свойства опухолевой ткани, которые могли бы состоят из потенциальных биомаркеров, способных прогнозировать реакцию пациентов на ИКИ.

Исследование Hoch et al. применили IMC в образцах метастатической меланомы, чтобы продемонстрировать, что конкретная экспрессия хемокинов CXCL9 и CXCL10 совместно локализована с CXCL13, экспрессирующими дисфункциональные Т-клетки, TCF7+ наивные Т-клетки, а также TLS и В-клетки, рекрутирование которых было связано с противоопухолевым иммунитетом и реакцией к ИКИ (16). Еще в области меланомы Martinez-Morilla et al. исследовали с использованием IMC корреляцию между особенностями TME и выживаемостью пациентов с метастатической меланомой, получавших ICI, и они указали некоторые потенциальные биомаркеры, представляющие потенциальный прогностический интерес, такие как уровень бета2-микроглобулина (40).

Санмамед и др. использовали IMC для изучения TIL в образцах немелкоклеточного рака легкого и идентифицировали новую субпопуляцию выгоревших CD8+ TIL (Ebo), которая особенно накапливалась в TME и представляла собой высокопролиферативную, гиперактивированную и апоптотически дисфункциональную субпопуляцию CD8+, проникающую в опухоль. которые продуцировали низкое количество INFγ, функционально отличное от истощенных Т-клеток. Расширение этой популяции Ebo TIL в зависимости от PD-1/B7-h2 было связано с устойчивостью к ICI (41).Чтобы стратифицировать пациентов, которые получат наибольшую пользу от комбинации химиотерапии с иммунотерапией против PD-L1 при мелкоклеточном раке легкого, был проведен анализ IMC для поиска прогностического биомаркера Le Noac’h et al. Результаты показали, что более высокая плотность CD4+, CD8+ и регуляторных Т-клеток в TME была заметно связана с более длительной выживаемостью без прогрессирования (PFS), как и с более высокой экспрессией гранзима B (42).

Бортоломеацци и др. использовали IMC в образцах колоректального рака и подчеркнули, что гипермутированные колоректальные раки с ответами на анти-PD-1 ICI содержат высокие уровни цитотоксических и пролиферирующих CD8 + PD-1 + T-клеток с высокими взаимодействиями с антиген-презентирующими макрофагами PD-L1 + (43).

Пытаясь лучше понять отсутствие ответа у пациентов с распространенным раком желчевыводящих путей на лечение ICI анти-PD-1, Umemoto et al. проанализировали TME образцов пациентов с раком желчевыводящих путей с использованием IMC и обнаружили, что PD-1 + CD8 + T-клетки, которые, как известно, важны для ответа на терапию анти-PD-1, были не только выше на ранней стадии, чем на поздней стадии. рак, но они также были более многочисленны при непосредственном взаимодействии с опухолевыми клетками, тогда как CD8+ Т-клетки в строме, на расстоянии от опухолевых клеток, были в основном PD-1- (44).

Чжу и др. использовали IMC для сравнения состава опухоли и TME между образцами резистентного к платине эпителиального рака яичников до лечения и после лечения (комбинация анти-PD-L1 плюс анти-CTLA4) до лечения и после лечения ICI, и они описали, что уменьшение количества опухолевых клеток при лечении было связано с увеличением числа CD8+ Т-клеток, при этом увеличение количества клеток CD8+ и FoxP3+ более важно у пациентов, которые лучше всего реагируют на ICI (45).

Чжан и др. применили анализ IMC к образцам опухолей после неоадъювантного лечения пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, получавших комбинацию кабозантиниба (ингибитора тирозинкиназы) и ниволумаба (анти-PD-1 ICI), чтобы указать, что образцы респондеров содержали TLS и более высокое содержание нескольких иммунных клетки как CD4+ и CD8+ Т-клетки, но также и более высокие взаимодействия между различными иммунными клетками.У респондеров опухолевые клетки также больше взаимодействовали с лимфоидными клетками, тогда как у нереспондеров клетки CD8+ взаимодействовали с макрофагами CD163+. Чем важнее было расстояние между В- или Т-клетками и макрофагами CD163+Arg1+, тем важнее был ответ на лечение. Напротив, взаимодействие между CD163+ Ki-67+ макрофагами PD-L1+ и лимфоидными клетками было связано с ответом на лечение (46).

Улучшение прогнозирования прогрессирования рака и реакции рака на лечение без использования ИКИ

Учитывая большой опыт применения ИМК к образцам рака молочной железы, команда Боденмиллера особенно использовала ИМК для прогностических целей.В статье Ali et al. они указали на некоторые новые особенности TME, включая соседство клеток, которые могут представлять потенциальный прогностический интерес в этой области. Следует отметить, что в их работе IMC часто сочетали с методами геномики, чтобы лучше расшифровать сложность рака молочной железы на разных уровнях и соотнести эту сложность с прогностическими признаками (9, 14, 15, 19, 47). Тем не менее у пациентов с раком молочной железы Carvajal-Hausdorf et al. использовали IMC для корреляции экспрессии белка HER2 на плазматической мембране опухолевой клетки, количественного определения CD8+ Т-клеток и их пространственных взаимодействий с опухолевыми клетками HER2+, а также ответа на анти-HER2-терапию трастузумабом.Они продемонстрировали, что экспрессия внеклеточного домена HER2 и его близость к CD8+ Т-клеткам были связаны с реакцией на лечение, подтверждая роль иммунной системы в действии этой таргетной противораковой терапии (48).

Хав и др. использовали IMC для фенотипирования клеток в образцах диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы и сообщили о высокой прогностической ценности опухолевых клеток CCR4+Tim3+PD-L1+ в дополнение к пространственным взаимодействиям с участием CD8+ Т-клеток, которые сильно коррелировали с клиническим ответом на химиотерапию. (49, 50).Кроме того, они также наблюдали, что цитотоксические Т-клетки granzymeB+CD8+ часто ассоциировались с полным ответом на химиотерапию, как и положение CD4+ Т-клеток, закрытое от кровеносных сосудов. Наоборот, маркеры истощения (Tim3 и Lag3) были связаны с рефрактерностью заболевания, как и расположение CD4+ Т-клеток дальше от кровеносных сосудов. При отдельном анализе большой В-клеточной лимфомы В-клеточного типа с зародышевым центром и В-клеточного типа с негерминальным центром в последнем высокий уровень регуляторных Т-клеток также был связан с рефрактерным заболеванием (51).

Чжу и др. исследовали прогностическую значимость состава ТМЭ, проанализированного с помощью ИМК при высокозлокачественном серозном раке яичников, и выявили некоторые особенности, связанные с долгосрочной выживаемостью (высокий уровень гранзима В+ CD8+ Т-клеток, CD11b+Vista+ клеток и взаимодействия между гранзимом В+ CD8+ Т-клетками и Т-клетки Vista-CD4+; низкие уровни клеток CD196+, CD45RO+ и CD73+ и плохое взаимодействие между клетками CD73+ и Т-клетками Vista-CD4+, макрофагами и В-клетками) (22, 52). Стробл и соавт.также опубликовали некоторые предварительные результаты по раку яичников, пытаясь смоделировать пространственный состав и эволюцию рака яичников TME на основе данных IMC. Это моделирование может представлять потенциальный интерес для лучшего понимания развития опухоли и ответа на химиотерапию (21).

Визуализация тканевых отложений лечения на основе платины

Поскольку IMC основан на обнаружении металлов в образцах тканей, он позволяет обнаруживать не только металлы, маркирующие антитела, используемые для обнаружения белков, но и уже присутствующие металлы. в образцах тканей как платина, которая содержится в некоторых химиотерапевтических препаратах.Таким образом, IMC также использовался для исследования уровней платины в неопухолевых тканях и опухолевых тканях у пациентов, получавших химиотерапию на основе платины. Цао и соавт. особенно отметили, что уровень платины в образцах опухоли рака желудка с сильным связыванием с коллагеновыми волокнами коррелировал с улучшенным патологическим ответом (53). Они также доказали, что у пациентов с колоректальным раком, получавших химиотерапию на основе платины, отложения платины в коже сохранялись в течение нескольких лет после лечения и могли способствовать объяснению механизма связанной с платиной периферической сенсорной нейропатии как побочного эффекта лечения (54). .

Расшифровка прогрессирования рака и ответа на лечение на животных моделях

Помимо клинических образцов пациентов, IMC также применима для изучения животных моделей рака и линий опухолевых клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Применение IMC к этим моделям может позволить сравнить клетки и ткани в разные моменты времени лечения, после различных условий лечения и/или продемонстрировать специфическое влияние некоторых путей на архитектуру опухолевой ткани и агрессивность рака. .

Пример, выполненный их командой на образцах человека, Chang et al. также исследовали распределение химиотерапии на основе платины в нормальных и опухолевых тканях мышей с ксенотрансплантатами рака поджелудочной железы, полученными от пациентов, обнаружив такую ​​​​же фиксацию платины коллагеновыми волокнами, как и в образцах человека в нормальных и опухолевых тканях (55).

Дей и др. также применил IMC для изучения ксенотрансплантатов клеток аденокарциномы герцогства поджелудочной железы, полученных от пациентов, у мышей, чтобы расшифровать взаимодействия между раковыми клетками и клетками-хозяевами, а также роль онкогенной роли мутаций KRAS с точки зрения паракринной передачи сигналов (IL4 и IL13) и метаболического перепрограммирования. рак (56).Перан и соавт. также использовали ксенотрансплантат рака поджелудочной железы в моделях мышей с дефицитом CDh21 и мышей дикого типа, чтобы продемонстрировать с помощью IMC, что ингибирование CDh21, экспрессируемого ассоциированными с раком фибробластами, вызывает снижение роста опухоли, увеличивает ответ опухоли на гемцитабин и участвует в иммуносупрессии и отложения внеклеточного матрикса, состоящие из сильно фиброзной стромы аденокарциномы протоков поджелудочной железы (57). Еще об аденокарциноме протоков поджелудочной железы Raj et al. также использовали IMC-анализ моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, для изучения терапевтических эффектов переключаемых CAR-T-клеток, нацеленных на HER2. Этот терапевтический эффект сочетается с сильным увеличением пролиферации Т-клеток и увеличением продукции гранзима B (58). .

Rinkenbaugh et al. применили IMC к полученным от пациента моделям ксенотрансплантатов тройного негативного рака молочной железы для сравнения гетерогенности тканей до и после химиотерапевтического лечения, в образцах после лечения. Они обнаружили повышенную активацию пути PI3K/mTOR и локализованную передачу сигналов MAPK, что свидетельствует о появлении особых сигнальных ниш после химиотерапевтического лечения, которые могут способствовать химиорезистентности этих видов рака (59). Лю и соавт. также использовали IMC в области тройного негативного рака молочной железы, но анализировали не ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, а опухоли, возникающие в мышиной модели прогрессирующего тройного негативного рака молочной железы, в которой они сравнивали эффекты различных методов доставки лекарств в опухолевых и неопухолевых тканях. для поиска наилучшей эффективности в отношении опухоли и минимальной токсичности, связанной с лечением (60).Анализируя клетки рака молочной железы, трансплантированные на различных моделях мышей, в том числе с дефицитом фосфо-eIF4E, Guo et al. указали на роль оси MNK1/2-eIF4E в метастатическом распространении послеродового рака молочной железы, и они впоследствии использовали IMC для подтверждения наличия высоких уровней высокоэкспрессирующих фосфо-eIF4E опухолевых клеток и CD8+ T-клеток с активированными дисфункциональными маркеры фенотипа в образцах людей с этим конкретным клиническим проявлением агрессивного рака молочной железы, указывая, таким образом, на потенциальную новую терапевтическую мишень в этой области (61).

В области лечения ICI против PD-1 Somasundaram et al. создали модель гуманизированной мышиной меланомы для исследования тканевых эффектов анти-PD-1 ICI. Анализ IMC выявил рекрутирование Т-клеток FoxP3+ и тучных клеток, совместно локализованных в некоторых областях опухоли, которые также содержали сниженную экспрессию HLA-класса I и клетки CD8+GranzymeB+ и, таким образом, согласовывались с приобретением устойчивости к лечению ICI против PD-1. . Эта резистентность, связанная с инфильтрацией тучных клеток, была устранена с помощью ингибирующих CD117 терапий, истощающих тучные клетки, которые могли бы проложить новый путь для повышения эффективности лечения ICI против PD-1 с использованием комбинированных подходов (62).

Место масс-цитометрии с визуализацией в текущих и будущих исследованиях рака

Благодаря высокому уровню возможностей мультиплексирования IMC уже используется в нескольких приложениях, в частности, в исследованиях рака, о которых упоминалось выше. Тем не менее, он имеет ряд ограничений.

Длительное время и высокая стоимость анализа ИМК

Действительно, скорость сбора данных (около 100 минут на 1 мм² ткани) уже является устоявшимся ограничением ИМК, ограничивающим возможность получения при разумных затратах и ​​времени данных о от больших до целых областей слайдов.Это требует ограничения области анализа небольшими выбранными ROI. Чтобы оптимизировать количество ROI и/или различных тканей на предметное стекло IMC, можно использовать основные секции Tissue Micro Array (TMA). Стоимость анализов IMC также пропорциональна количеству и объему антител с металлическими метками для совместной инкубации в срезе ткани, соответственно, связанных с количеством маркеров для анализа и поверхностью ROI/среза ткани для исследования. В дополнение к стоимости самого автомата ИМК, все эти факторы делают ИМК дорогостоящим методом, который на самом деле трудно применять для рутинных диагностических приложений, подразумевающих анализ многочисленных и больших образцов тканей пациентов, особенно с онкологическими заболеваниями.Тем не менее, можно ожидать, что постепенное более широкое использование ИМК может также сопровождаться снижением затрат и оптимизацией времени и рабочего процесса процесса. В дополнение к его применению на классических двухмерных тонких срезах тканей или клетках, уложенных на предметные стекла, визуализация на основе IMC может быть даже расширена до трехмерного анализа тканей с помощью масс-томографии. Этот метод позволяет анализировать клеточное содержимое и взаимодействия в объеме и глубине ткани, и его возможность была продемонстрирована на образце рака молочной железы группой Bodenmiller et al.(47). Тем не менее, этот растущий уровень анализа также значительно увеличивает время приобретения и связанную с этим стоимость анализа, что на сегодняшний день является ограничением для его более широкого применения.

IMC среди других методов иммуномечения

Другие мультиплексные методы иммуномечения также могут использоваться для тех же целей, что и IMC с более низким уровнем мультиплексирования, как мультиплексная иммунофлуоресценция (до примерно 10 маркеров), или аналогичным уровнем мультиплексирования, как совместное обнаружение путем индексирования или флуоресцентная иммуногистополимеразная цепная реакция (т.грамм. CODEX) и мультиплексная ионно-лучевая визуализация (MIBI) TOF (до 50 маркеров на сегодняшний день). Методы с высокой степенью мультиплексирования имеют почти аналогичные ограничения с точки зрения времени и стоимости, а для методов на основе флуоресценции аутофлуоресценция и потенциальное затухание сигнала флуоресценции являются другими ограничениями, которые не следует принимать во внимание для методов на основе изотопов металлов (IMC и MIBI). . По сравнению с более новой технологией MIBI, IMC имеет недостаток, заключающийся в методе, подразумевающем лазерную абляцию ткани (и, следовательно, разрушение), и имеет разрешение 1 мкм, тогда как MIBI не разрушает ткани и допускает разрешение 200 нм. 63).И IMC, и MIBI также имеют общее ограничение в отношении маркеров, которые можно совместно анализировать на одном предметном стекле, что продиктовано количеством различных изотопов металлов, доступных для связывания Abs (10, 17, 64). В целом, в области методов иммунного мечения, мультиплексированных или нет, на самом деле разумно учитывать, что низкий уровень мультиплексирования, недорогие и быстрые методы для получения больших изображений (всего слайда) и клиническая применимость идут рука об руку, тогда как высокий уровень мультиплексирование требует сосредоточения внимания на ROI небольших тканей и требует больших затрат и времени на получение изображений и последующий анализ данных, которые фактически ограничиваются исследовательскими приложениями, а не рутинной медицинской помощью.Таким образом, по нашему мнению, техническая экосистема, объединяющая как низкоуровневые (для валидации и клинических применений), так и высокоуровневые (для целей исследования новых фенотипических и пространственных параметров, представляющих потенциальный клинический интерес) мультиплексные методы иммуномаркировки, такие как IMC, остается необходимой. и дополняют трансляционные исследования рака.

На пути к более глубокому анализу тканей с использованием ИМК и пространственной транскриптомики

За последние десятилетия достигнут большой прогресс в возможности всестороннего анализа генома (ДНК) и транскриптома (РНК) клеток, в том числе опухолевых, в плане выделения из целой ткани/смеси клеток, но также и для предоставления информации на уровне одной клетки.До недавнего времени эта молекулярная информация была отделена от морфологических и архитектурных данных, из которых были извлечены клетки/нуклеиновая кислота, но с текущим развитием новых технологий, заключающихся в пространственной транскриптомике, становится все более и более доступным получение исчерпывающих данных о экспрессия генома через транскриптом путем анализа РНК клеток в их тканевом контексте. Эти революционные методы позволят продолжать повышать уровень комплексного анализа участков ткани (на сегодняшний день) до отдельных клеток (в ближайшем будущем) из свежих, а также фиксированных образцов клеток и тканей.Столкнувшись с продолжающейся технической революцией в пространственной транскриптомике, можно попросить место мультиплексных методов иммуномаркировки в качестве IMC (65). Учитывая соображения стоимости и времени, а также доступность различных методов, а также их различные мишени (клеточная РНК для пространственной транскриптомики и белки внутри клетки, а также неклеточные компоненты ткани для методов иммуномечения), как пространственная транскриптомика, так и мультиплексное иммуномечение методы, вероятно, позволят получить и сопоставить дополнительные данные в последовательных срезах тканей или, возможно, в одном предметном стекле.Это позволит получить более глубокую характеристику фенотипов и функциональных особенностей клеток, взаимодействующих в нормальных и патологических тканях, в том числе раковых, для лучшего понимания прогрессирования рака и открытия новых данных диагностического, прогностического и терапевтического значения для улучшения ведения пациентов. .

Заключение

Учитывая сложность и гетерогенность физиопатологии рака в целом, методы, позволяющие одновременно получать данные о различных маркерах и сохранять информацию об архитектуре тканей, количественных оценках клеточных субпопуляций и взаимодействиях, представляют собой значительный технический прогресс для лучшего понимания механизмы, поддерживающие прогрессирование рака.IMC — это такой метод, применимый к образцам клеток и тканей рака, которые ежедневно изучаются патологоанатомами в диагностических, прогностических и терапевтических целях. В сочетании с революциями в иммуноокрашивании и цифровой патологии и в то время, когда молекулярная патология объединяется с пространственными данными, отражающими архитектуру раковой ткани посредством развития пространственной транскриптомики, несомненно, что расшифровка фенотипов, функций и взаимодействий клеток в раковых тканях посредством мультиплексные методы иммуномаркировки, такие как IMC, станут ключом к открытиям и трансляционным приложениям для диагностических, прогностических и терапевтических целей, обуславливающих ведение пациентов с раком для лучшего терапевтического выбора в эпоху персонализированной терапии рака.

Вклад авторов

MLR провел обзор литературы. MLR и AU написали рукописи. Все авторы внесли свой вклад в редактирование рукописи. Все авторы соглашаются нести ответственность за содержание работы. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

LBAI был поддержан AgenceNationale de la Recherche в рамках программы «Investissementd’Avenir» со ссылкой ANR-11-LABX-0016-001 (Labex IGO). Авторы выражают признательность Центру цитометрии Hyperion (Брест, Франция) за техническую помощь, а также Европейской грантовой программе FEDER Progos RU 000950, а также «La Region Bretagne» и «La Ligue contre le Cancer» за поддержку. .

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечания издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Ссылки

1. Торре Л.А., Сигел Р.Л., Уорд Э.М., Джемал А. Глобальная заболеваемость раком, показатели смертности и тенденции — обновление. Cancer Epidemiol Предыдущая статья Biomark (2016) 25(1):16–27. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-15-0578

CrossRef Full Text | Google Scholar

2. Elaldi R, Hemon P, Petti L, Cosson E, Desrues B, Sudaka A, et al. Панель масс-цитометрии с высокоразмерной визуализацией для визуализации контекста иммунной микросреды опухоли. Фронт Иммунол (2021) 12:1254.doi: 10.3389/fimmu.2021.666233

Полный текст CrossRef | Google Scholar

3. Брабек Дж., Мирке К.Т., Розель Д., Весели П., Фабри Б. Роль тканевой микросреды в регуляции подвижности и инвазии раковых клеток. Сигнал сотовой связи (2010) 8(1):22. doi: 10.1186/1478-811X-8-22

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

4. Oliver AJ, Lau PKH, Unsworth AS, Loi S, Darcy PK, Kershaw MH, et al. Тканезависимое микроокружение опухоли и его влияние на ответ иммунотерапии. Фронт Иммунол (2018) 9:70. doi: 10.3389/fimmu.2018.00070

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

5. Шрайбер Р.Д., Олд Л.Дж., Смит М.Дж. Иммуноредактирование рака: интеграция роли иммунитета в подавлении и развитии рака. Science (2011) 331(6024):1565–70. doi: 10.1126/science.1203486

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

6. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger SN, Smith DC, McDermott DF, et al.Безопасность, активность и иммунные корреляты антитела анти-PD-1 при раке. N Engl J Med (2012) 366 (26): 2443–54. doi: 10.1056/NEJMoa1200690

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

7. Гохил С.Х., Иоргулеску Дж.Б., Браун Д.А., Кескин Д.Б., Ливак К.Дж. Применение высокоразмерных одноклеточных технологий для анализа иммунотерапии рака. Nat Rev Clin Oncol (2021) 18(4):244–56. doi: 10.1038/s41571-020-00449-x

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

8.Чанг К., Орнатский О.И., Сиддики И., Лобода А., Баранов В.И., Хедли Д.В. Визуализирующая масс-цитометрия. Cytom A (2017) 91(2):160–9. doi: 10.1002/cyto.a.23053

Полный текст CrossRef | Google Scholar

9. Giesen C, Wang HAO, Schapiro D, Zivanovic N, Jacobs A, Hattendorf B, et al. Высокомультиплексная визуализация опухолевых тканей с субклеточным разрешением с помощью масс-цитометрии. Nat Methods (2014) 11(4):417–22. doi: 10.1038/nmeth.2869

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

10.Бахарлоу Х., Канете Н.П., Каннингем А.Л., Харман А.Н., Патрик Э. Масс-цитометрическая визуализация для изучения болезней человека — приложения и стратегии анализа данных. Фронт Иммунол (2019) 10:2657. doi: 10.3389/fimmu.2019.02657

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

12. Мавропулос А., Лин Д., Лам Б., Бисгроув Д., Орнацкий О. Эквивалентность масс-цитометрии изображений и иммунофлуоресценции на срезах тканей FFPE. Компания Fluidigm (2012) 12:1–12.

Google Scholar

13. Baars MJD, Sinha N, Amini M, Pieterman-Bos A, van Dam S, Ganpat MMP, et al. MATISSE: метод улучшенной сегментации одиночных клеток в масс-цитометрии с визуализацией. BMC Biol (2021) 19(1):99. doi: 10.1186/s12915-021-01043-y

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

14. Ali HR, Jackson HW, Zanotelli VRT, Danenberg E, Fischer JR, Bardwell H, et al. Визуализирующая масс-цитометрия и мультиплатформенная геномика определяют феногеномный ландшафт рака молочной железы. Nat Cancer (2020) 1(2):163–75. doi: 10.1038/s43018-020-0026-6

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

15. Schulz D, Zanotelli VRT, Fischer JR, Schapiro D, Engler S, Lun X-K, et al. Одновременная мультиплексная визуализация мРНК и белков с субклеточным разрешением в образцах ткани рака молочной железы с помощью масс-цитометрии. Cell Syst (2018) 6(1):25–36.e5. doi: 10.1016/j.cels.2017.12.001

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

17.Эйссельстейн М.Э., Ван дер Брегген Р., Фарина Сараскета А., Конинг Ф., Де Миранда NFCC. Панель из 40 маркеров для многомерной характеристики микроокружения иммунитета к раку с помощью масс-цитометрии с визуализацией. Фронт Иммунол (2019) 10:2534. doi: 10.3389/fimmu.2019.02534

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

18. Schürch CM, Bhate SS, Barlow GL, Phillips DJ, Noti L, Zlobec I, et al. Скоординированные клеточные соседи организуют противоопухолевый иммунитет на инвазивном фронте колоректального рака. Cell (2020) 182(5):1341–59.e19. doi: 10.1016/j.cell.2020.07.005

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

19. Schulz D, Renaud-Tissot S, Liechti R, Eling N, Daniel M, Windhager J, et al. Резюме 2756: Набор инструментов, обеспечивающий управляемый данными выбор областей интереса в срезах опухолевой ткани для анализа масс-цитометрии с визуализацией. Cancer Res (2021) 81 (13 Supplement): 2756–6. doi: 10.1158/1538-7445.AM2021-2756

CrossRef Полный текст | Академия Google

20.Се С., Чжан X-Y, Шан X-F, Яу В., Чжан J-Y, Ван В и др. Анализ изображений Hyperion изображает предварительный ландшафт иммунной микросреды опухоли при OSCC с метастазами в лимфатические узлы. J Immunol Res (2021) 2021:9975423. doi: 10.1155/2021/9975423

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

21. Strobl M, Wicker M, Adhikarla V, Shockey WA, Lakatos E, Pooladvand P, et al. Связь ниши микросреды с реакцией на лечение при раке яичников. Cancer Biol (2018). doi: 10.1101/452052

CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Zhu Y, Sheng J, Ferri-Borgogno S, Yeung T-L, Burks JK, Mok SC, et al. Резюме 854: Конвейер искусственного интеллекта для анализа данных массовой цитометрии изображений и его применения в обнаружении прогностических биомаркеров рака яичников. Cancer Res (2020) 80 (16 Supplement): 854–4. doi: 10.1158/1538-7445.AM2020-854

CrossRef Полный текст | Академия Google

23.Аоки Т., Чонг Л.С., Таката К., Милн К., Хав М., Коломбо А. и др. Анализ одноклеточного транскриптома выявляет определяющие заболевание подмножества Т-клеток в микроокружении опухоли при классической лимфоме Ходжкина. Рак Дисков (2020) 10 (3): 406–21. doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0680

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

24. Li R, Lin Y, Wang Y, Wang S, Yang Y, Mu X и ​​другие. Характеристика иммунного микроокружения опухоли при плоскоклеточной карциноме легкого с помощью масс-цитометрии с визуализацией. Передний Oncol (2021) 11:1034. doi: 10.3389/fonc.2021.620989

Полный текст CrossRef | Google Scholar

25. Отьен К.А., Бендер Д.Е., Рузинова М.Б., Фишер Д.А.К., О С.Т., Линк Д.К. Визуализирующая масс-цитометрия выявляет пространственную архитектуру миелодиспластических синдромов и вторичных острых миелоидных лейкозов. Кровь (2020) 5136:44–5. doi: 10.1182/blood-2020-142238

CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Василевская Т., Чанг К., Талаи Н., Бэкман М., Понтен Ф., Орнацкий О.PO-463 Многопараметрический анализ срезов ткани рака легкого с использованием масс-цитометрии с визуализацией. ESMO Open (2018) 3:A412. doi: 10.1136/esmoopen-2018-EACR25.970

Полный текст CrossRef | Google Scholar

27. Singh M, Chaudhry P, Gerdtsson E, Maoz A, Cozen W, Hicks J, et al. Масс-цитометрия с высокой мультиплексной визуализацией позволяет визуализировать взаимодействие опухоли и иммунных клеток с микроокружением опухоли в срезах ткани FFPE. Кровь (2017) 130 (Приложение 1): 2751.doi: 10.1182/blood.V130.Suppl_1.2751.2751

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Tran M, Su A, Lee H, Cruz R, Pflieger L, Dean A, et al. 665 Пространственный одноклеточный анализ опухоли колоректального рака с использованием масс-цитометрии с мультиплексной визуализацией. J Immunother Cancer (2020) 8 (Приложение 3): 399. doi: 10.1136/jitc-2020-SITC2020.0665

Полный текст CrossRef | Google Scholar

29. Ijsselsteijn ME, Somarakis A, Lelieveldt BPF, Höllt T, de Miranda NFCC.Полуавтоматическое удаление фона ограничивает потерю данных и нормализует данные масс-цитометрии. Cytom A (2021) 99:1187–97. doi: 10.1002/cyto.a.24480

Полный текст CrossRef | Google Scholar

31. Gerdtsson E, Pore M, Thiele J-A, Gerdtsson AS, Malihi PD, Nevarez R, et al. Мультиплексное обнаружение белка в циркулирующих опухолевых клетках из жидкой биопсии с использованием масс-цитометрии с визуализацией. Converg Sci Phys Oncol (2018) 4(1):015002. doi: 10.1088/2057-1739/aaa013

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

32.Батт И.С., Менг К., Ван К., Торрес К.Е., Беркс Дж., Ван Дж. и др. Массив белков редкой субпопуляции клеток остеосаркомы и профилирование с использованием масс-цитометрии изображений и биоинформатического анализа. BMC Cancer (2020) 20(1):715. doi: 10.1186/s12885-020-07203-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

33. Elyada E, Bolisetty M, Laise P, Flynn WF, Courtois ET, Burkhart RA, et al. Межвидовой одноклеточный анализ аденокарциномы протоков поджелудочной железы выявляет антиген-представляющие рак-ассоциированные фибробласты. Рак Discov (2019) 9(8):1102–23. doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0094

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

34. Zhang T, Lv J, Tan Z, Wang B, Warden AR, Li Y, et al. Профилирование иммуноцитов с использованием одноклеточной масс-цитометрии выявило аномалии EpCAM+ CD4+ T-клеток при раке толстой кишки. Фронт Иммунол (2019) 10:1571. doi: 10.3389/fimmu.2019.01571

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

35. Podojil JR, Glaser AP, Baker D, Courtois ET, Fantini D, Yu Y, et al.Нацеливание антител на B7-h5 усиливает иммунный ответ при уротелиальной карциноме. Онкоиммунология (2020) 9(1):1744897. doi: 10.1080/2162402X.2020.1744897

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

36. Xiang H, Ramil CP, Hai J, Zhang C, Wang H, Watkins AA, et al. Связанные с раком фибробласты способствуют иммуносупрессии, индуцируя моноцитарные MDSC, генерирующие АФК, при плоскоклеточной карциноме легких. Cancer Immunol Res (2020) 8(4):436–50. дои: 10.1158/2326-6066.CIR-19-0507

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

37. Malihi PD, Morikado M, Welter L, Liu ST, Miller ET, Cadaneanu RM, et al. Клональное разнообразие, выявленное с помощью морфопротеомных и копийных профилей одиночных клеток рака предстательной железы при диагностике. Converg Sci Phys Oncol (2018) 4(1):015003. doi: 10.1088/2057-1739/aaa00b

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

38. Cun H, Zhu Y, Borgogno SF, Sheng J, Cheng R, Kim J-H, et al.Светлоклеточные опухоли яичников демонстрируют уникальную иммунную микросреду опухоли. Gynecol Oncol (2021) 162:S110–1. doi: 10.1016/S0090-8258(21)00852-0

Полный текст CrossRef | Google Scholar

39. Юсуф Р., Вильярроэль-Эспиндола Ф., Шальпер К., Эму Б. P1.04-23 Характеристика иммунного микроокружения опухоли при немелкоклеточном раке легкого у людей, живущих с ВИЧ, с использованием масс-цитометрии. J Thorac Oncol (2019) 14(10):S448. doi: 10.1016/j.jtho.2019.08.926

CrossRef Полный текст | Академия Google

40.Мартинес-Морилья С., Вильярроэль-Эспиндола Ф., Вонг П.Ф., Токи М.И., Аунг Т.Н., Пелекану В. и др. Обнаружение биомаркеров у пациентов с меланомой, леченной иммунотерапией, с помощью масс-цитометрии с визуализацией. Clin Cancer Res (2021) 27(7):1987–96. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-3340

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

41. Санмамед М.Ф., Ни Х, Десаи С.С., Виллароэль-Эспиндола Ф., Бадри Т., Чжао Д. и др. Сгоревшая субпопуляция Т-клеток CD8+ расширяется в микроокружении опухоли и сдерживает иммунотерапию рака. Рак Discov (2021) 11(7):1700–15. doi: 10.1158/2159-8290.CD-20-0962

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

42. Noac’h PL, Hemon P, Benguigui D, Robinet G, Descourt R, Quere G, et al. 71p Поиск прогностических биомаркеров эффективности у пациентов с мелкоклеточным раком легкого (МРЛ), получавших комбинацию химиотерапии и иммунотерапии, с использованием масс-цитометрии с визуализацией (исследование HYPE). Энн Онкол (2021) 32:S386. doi: 10.1016/j.annonc.2021.08.351

CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Umemoto K, Togashi Y, Arai Y, Nakamura H, Takahashi S, Tanegashima T, et al. Возможное применение блокады PD-1 при раке желчевыводящих путей на ранней стадии. Int Immunol (2020) 32(4):273–81. doi: 10.1093/intimm/dxz080

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

45. Zhu Y, Yeung T-L, Sheng J, Hinchcliff EM, Burks JK, Jazaeri AA, et al. (2019). Конвейер информатики изображений для визуализации масс-цитометрии для характеристики иммунного ландшафта в иммунотерапии до и после лечения и ее применения при рецидивирующем платини-резистентном эпителиальном раке яичников, в: 2019 IEEE EMBS Международная конференция по биомедицинской информатике в области здравоохранения (BHI) 1– 4.

Google Scholar

46. Zhang S, Zhu Q, Gross N, Charmsaz S, Deshpande A, Xavier S, et al. Abstract 1682: Масс-цитометрия с визуализацией выявляет ключевые пространственные особенности среди иммунных клеток при гепатоцеллюлярных карциномах, получавших неоадъювантную терапию кабозантинибом и ниволумабом. Cancer Res (2021) 81 (13 Supplement): 1682–2. doi: 10.1158/1538-7445.AM2021-1682

CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Kuett L, Catena R, Özcan A, Pluss A, Schraml P, Moch H, et al.Масс-цитометрия с трехмерной визуализацией для высокомультиплексного молекулярного и клеточного картирования тканей и микроокружения опухоли. Nat Cancer (2022) 3(1):122–33. doi: 10.1038/s43018-021-00301-w

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

48. Carvajal-Hausdorf DE, Patsenker J, Stanton KP, Villarroel-Espindola F, Esch A, Montgomery RR, et al. Мультиплексное (18-плексное) измерение сигнальных мишеней и цитотоксических Т-клеток у пациентов, получавших трастузумаб, с использованием масс-цитометрии с визуализацией. Clin Cancer Res (2019) 25(10):3054–62. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-2599

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

49. Хав М., Коломбо А., Гердтссон Э., Сингх М., Чен Д., Хикс Дж. и др. Визуализирующая масс-цитометрия выявляет опухоли и иммунные пространственные и фенотипические кластеры, связанные с клиническими исходами при диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме . Рочестер, Нью-Йорк: Сеть исследований в области социальных наук (2019). Доступно по адресу: https://papers.ssrn.com/abstract=3464030.

Google Scholar

51. Hav M, Gerdtsson E, Singh M, Colombo A, Hicks J, Kuhn P, et al. Abstract 2789: Масс-цитометрия с высокомультиплексной визуализацией выявляет состав иммунных клеток и пространственную неоднородность при диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме, связанную с исходом лечения. Cancer Res (2019) 79 (13 Supplement): 2789–9. doi: 10.1158/1538-7445.AM2019-2789

CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Zhu Y, Ferri-Borgogno S, Sheng J, Yeung T-L, Burks JK, Cappello P, et al.SIO: Трубопровод Spatioimageomics для определения прогностических биомаркеров, связанных с микросредой опухоли яичников. Раки (2021) 13(8):1777. doi: 10.3390/cancers13081777

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

53. Cao Y, Chang Q, Cabanero M, Zhang W, Hafezi-Bakhtiari S, Hedley D, et al. Концентрация платины в опухоли и патологические реакции после химиотерапии, содержащей цисплатин, у пациентов с раком желудка. J Gastrointest Cancer (2019) 50(4):801–7.doi: 10.1007/s12029-018-0153-9

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

54. Цао Ю., Чанг К., Чжан В., Орнатский О., Хедли Д., Чен ЭКС. Отложение платины в коже у пациентов с колоректальным раком после терапии на основе оксалиплатина. Cancer Chemother Pharmacol (2019) 84(6):1195–200. doi: 10.1007/s00280-019-03956-6

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

55. Чанг К., Орнатский О.И., Сиддики И., Штраус Р., Баранов В.И., Хедли Д.В.Биораспределение цисплатина, выявленное с помощью масс-цитометрии с визуализацией, идентифицирует обширное связывание коллагена в опухолевых и нормальных тканях. Научный представитель (2016) 6(1):36641. doi: 10.1038/srep36641

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

56. Dey P, Li J, Zhang J, Chaurasiya S, Strom A, Wang H, et al. Метаболическое перепрограммирование онкогенных красителей в раковых клетках поджелудочной железы использует цитокины из микроокружения опухоли. Рак Дисков (2020) 10 (4): 608–25.doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0297

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

57. Перан И., Дакшанамурти С., Маккой М.Д., Мавропулос А., Алло Б., Себастьян А. и др. Кадгерин 11 способствует иммуносупрессии и отложению внеклеточного матрикса для поддержки роста опухолей поджелудочной железы и устойчивости к гемцитабину у мышей. Гастроэнтерология (2021) 160(4):1359–72.e13. doi: 10.1053/j.gastro.2020.11.044

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

58.Радж Д., Ян М.Х., Роджерс Д., Хэмптон Э.Н., Бегум Дж., Мустафа А. и др. Переключаемые CAR-T-клетки опосредуют ремиссию при метастатической протоковой аденокарциноме поджелудочной железы. Гут (2019) 68 (6): 1052–64. doi: 10.1136/gutjnl-2018-316595

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

59. Rinkenbaugh AL, Sinha VC, Echeverria GV, Zhang X, Shao J, Symmans WF, et al. Abstract 1513: Анализ пространственно-временной фенотипической гетерогенности при химиорезистентном тройном негативном раке молочной железы с использованием масс-цитометрии с визуализацией. Cancer Res (2020) 80 (16 Supplement): 1513–3. doi: 10.1158/1538-7445.AM2020-1513

CrossRef Полный текст | Google Scholar

60. Liu HC, Viswanath DI, Pesaresi F, Xu Y, Zhang L, Di Trani N, et al. Потенцирование противоопухолевой эффективности посредством облучения и устойчивой внутриопухолевой доставки анти-CD40 и анти-Pdl1. Int J Radiat Oncol Biol Phys (2021) 110(2):492–506. doi: 10.1016/j.ijrobp.2020.07.2326

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

61.Guo Q, Bartish M, Goncalves C, Huang F, Smith-Voudouris J, Krisna SS, et al. Ось MNK1/2-Eif4e поддерживает подавление иммунитета и метастазирование при послеродовом раке молочной железы. Cancer Res (2021) 81 (14): 3876–89. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-20-3143

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

62. Somasundaram R, Connelly T, Choi R, Choi H, Samarkina A, Li L, et al. Тучные клетки, инфильтрирующие опухоль, связаны с устойчивостью к терапии анти-PD-1. Нац. коммуна (2021) 12(1):346.doi: 10.1038/s41467-020-20600-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

63. Парра Э. Р., Франсиско-Крус А., Вистуба II. Современное состояние профилирования иммунного контекста в эпоху мультиплексного окрашивания и цифрового анализа для изучения парафиновых опухолевых тканей. Раки (2019) 11(2):E247. doi: 10.3390/cancers11020247

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

64. Baca Q, Cosma A, Nolan G, Gaudilliere B. Путь вперед: внедрение масс-цитометрии в клинических исследованиях, по одной клетке за раз. Cytom B Clin Cytom (2017) 92(1):10–1. doi: 10.1002/cyto.b.21497

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Секвенирование всего генома выявило регуляторные и новые генные варианты при детской кардиомиопатии

РЕФЕРАТ

Кардиомиопатия (КМП) — это наследственное генетическое заболевание. Варианты кодирования белка составляют 20-30% случаев. Вклад вариантов в некодирующие элементы ДНК, которые регулируют экспрессию генов, не изучался. Мы выполнили полногеномное секвенирование (WGS) 228 неродственных семейств CMP.Помимо вариантов, кодирующих патогенный белок, в известных генах CMP, в 5% случаев обнаруживались редкие варианты с потерей функции в новых кардиальных генах, причем NRAP и FHOD3 были сильными кандидатами. WGS также выявил большое количество вариантов высокого риска в промоторах и энхансерах генов CMP в дополнительных 20% случаев (отношение шансов 2,14, 95% ДИ 1,60–2,86, p = 5,26 × 10 -7 против 1326 контролей) с гены, участвующие в гликозилировании α-дистрогликана ( FKTN, DTNA ) и передаче десмосомных сигналов ( DSC2, DSG2 ), специально обогащены регуляторными вариантами (частота ложных открытий <0.03). Эти результаты были независимо воспроизведены в когорте CMP Genomics England (n = 1266). Функциональный эффект некодирующих вариантов на транскрипцию был функционально подтвержден в миокарде пациентов и репортерных анализах в кардиомиоцитах человека, а также эффект новых вариантов гена в нокаутах рыбок данио. Наши результаты показывают, что функционально активные варианты в новых генах и в регуляторных элементах генов CMP вносят значительный вклад в геномную этиологию CMP в детском возрасте.

ВВЕДЕНИЕ

Кардиомиопатия (КМП) представляет собой генетическое заболевание сердечной мышцы с распространенностью от 1:500 до 1:2500 в общей популяции (в зависимости от типа КМП).По оценкам, более 20 миллионов человек во всем мире живут с этим заболеванием 1 . Фактическая распространенность оценивается еще выше, учитывая, что у многих пациентов с дефектом гена болезнь еще не проявилась. Только в Северной Америке ежегодно диагностируется несколько тысяч новых случаев CMP 2 . Более трети случаев передаются по наследству, а остальные являются спорадическими 3 . Большинство из них имеют аутосомно-доминантный характер и вызваны редкими повреждающими вариантами генов, которые влияют на структуру и функцию мышц 4,5 .Различают пять фенотипов: гипертрофический (ГКМП), дилатационный (ДКМП), рестриктивный (РКМ), некомпактную кардиомиопатию левого желудочка (ЛЖНК) и аритмогенную желудочковую кардиомиопатию (АВК). Заболевание имеет высокую пенетрантность в детском возрасте 6 , при этом КМП является ведущей причиной сердечной недостаточности и внезапной сердечной смерти у детей 7 . Предполагается, что большая тяжесть заболевания при дебюте КМП в детском возрасте частично связана с генетическими различиями, которые систематически не оценивались 8 .

Существует значительное генетическое перекрытие между различными подтипами CMP. В то время как саркомерные гены, включая MYH7 и MYBPC3 , объясняют примерно 50% всех случаев ГКМП, другие CMP являются более полигенными, и, несмотря на включение более 100 предполагаемых генов заболевания CMP в панели клинических диагностических тестов, более 70% CMPs остаются неуловимыми для генов (включая семейные случаи) 9–11 . Отчасти это связано с тем, что стандартные тесты панели генов обычно фиксируют только небольшие варианты на уровне последовательности в кодирующих областях известных генов CMP и пропускают трудно секвенируемые области, большинство событий интронного сплайсинга, структурные вариации и новые гены, не включенные в панели. .Важно отметить, что эти тесты не оценивают некодирующий геном, который содержит регуляторные последовательности ДНК, включая сердцевинные и проксимальные промоторы и энхансеры, а также дистальные регуляторные элементы 12 . Эти варианты могут нарушать процесс активации транскрипции посредством множества механизмов, включая изменения в структуре хроматина, некодирующих РНК, стабильности транскриптов и, что важно, посредством изменения ДНК-последовательности сайтов связывания факторов транскрипции (TFBS).

Растущее число исследований секвенирования всего генома (WGS) выявляют новые генетические варианты при педиатрических и семейных заболеваниях 13–15 .При расстройстве аутистического спектра, сложном генетическом заболевании, WGS позволил идентифицировать предполагаемые некодирующие области как горячие точки для de novo вариантов зародышевой линии 16,17 , новых генов-кандидатов риска 18 , а новые механизмы мутации были обнаружены только по WGS 19,20 . Совсем недавно WGS выявил более высокую нагрузку вариантов de novo в энхансерах ассоциированных с заболеванием генов у пациентов с врожденными пороками сердца по сравнению с контрольной группой 21 .Однако только 5 из 31 идентифицированного энхансера были связаны с измененными уровнями транскрипции генов-мишеней. По сравнению с ИБС, которая представляет собой сложное заболевание, включающее не только генетические, но и экологические причины, роль регуляторных вариантов не изучалась при КМП, преимущественно генетическом заболевании.

Здесь мы использовали WGS, чтобы охарактеризовать все классы генетической изменчивости в уникальной и исчерпывающей фенотипической когорте, установленной для CMP с началом в детстве. WGS идентифицировал 11 новых генов, важных для клинического диагностического тестирования, а также выявил значительно более высокое бремя регуляторных вариантов в генах CMP в 20% случаев по сравнению с контролем, результаты, которые были воспроизведены в независимой когорте CMP.Функция наиболее важных идентифицированных вариантов была подтверждена исследованием экспрессии эндогенных генов в миокарде пациентов, анализами на основе клеток человека 22,23 и редактированием генов CRISPR эмбрионов рыбок данио, что обеспечило парадигму для интерпретации WGS в будущих геномных исследованиях CMP с началом в детском возрасте, а также другие генетические нарушения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Варианты выхода на WGS в когорте обнаружения

В когорту открытия входило 228 неродственных пробандов в возрасте до 21 года на момент постановки диагноза первичного CMP и 69 больных и здоровых членов семьи ( Дополнительная таблица 1 ).Когорта включала 49% DCM, 33% HCM, 7% LVNC, 6% RCM и 3% AVC. 29% случаев имели положительный семейный анамнез CMP. WGS выполняли на геномной ДНК с использованием платформы Illumina HiSeq X при среднем охвате секвенирования 31X (диапазон: 20-50X). Мы опросили 133 гена, представленных в различных коммерческих панелях генов CMP (, дополнительная таблица 2, ), на наличие редких [частота минорного аллеля популяции (MAF) <0,01%], предсказывали повреждающие миссенс, потерю функции (LoF) (сдвиг рамки считывания, остановку усиления/ стоп-лосс, сплайсинг) и регуляторные варианты с высоким риском. На рис. 1a показан рабочий процесс фильтрации патогенных и вероятно патогенных кодирующих белок однонуклеотидных вариантов (SNV), вставок-делеций (indels), вариантов числа копий (CNV) и регуляторных вариантов высокого риска в общей когорте. Варианты, кодирующие белок, были классифицированы как патогенные (включая вероятно патогенные) с использованием критериев Американского колледжа медицинской генетики (ACMG) 17,24–30 . Патогенные белок-кодирующие SNV и индели в известных генах CMP были обнаружены в 78/228 (34%) случаях, а CNV — в 6/228 (2%) случаях.Только в двух случаях были обнаружены гомозиготные варианты. Дополнительные 20% случаев содержали варианты высокого риска в регуляторных элементах генов CMP, а 5% случаев содержали вероятно патогенные варианты LoF в новых генах-кандидатах (, рис. 1b, ). Распределение вариантов по подтипу CMP, по пациентам и по категориям генов показано на рисунках 1c-e .

Рисунок 1: Количество кодирующих белок и регуляторных вариантов в 228 неродственных случаях CMP у детей.

(a) Блок-схема, показывающая процесс селекции и выход кодирующих белок и регуляторных вариантов в общей когорте и в подмножестве неуловимых генов.36% всех случаев содержали по крайней мере один вариант, кодирующий патогенный белок, в гене CMP; среди оставшихся 146 неуловимых случаев гена 20% содержали по крайней мере один регуляторный вариант высокого риска в гене CMP; и еще 5% содержали вариант LoF в новом гене. ( b ) Круговая диаграмма, показывающая распределение кодирующих белок и регуляторных вариантов в генах CMP и вариантов LoF в новых генах в когорте (n = 228). WGS идентифицировала предположительно причинные белок-кодирующие SNV/indels/CNV в генах CMP в 36% случаев, варианты высокого риска в регуляторных элементах генов CMP еще в 20% случаев и варианты потери функции (LoF) в новых генах в еще 5% случаев.( c ) Распределение вариантов по подтипам CMP: случаи HCM имели более высокий выход вариантов, кодирующих патогенный белок, по сравнению с другими подтипами CMP (OR 3,14, CI 1,77–5,57, p = 1,22 × 10 -4 ). ( d ) Бремя вариантов у пациентов в когорте: 11 случаев (5%) имели множественные кодирующие белок варианты в известных генах CMP, 10 случаев (4%) имели множественные регуляторные варианты и 23 случая (10%) имели оба варианта. белок-кодирующие и регуляторные варианты в генах CMP. ( e ) Распределение вариантов по функциональным категориям генов: из всех вариантов, кодирующих патогенный белок, 64% были в саркомерных генах, что представляло собой значительное обогащение по сравнению с другими категориями генов (биномиальное p = 3.16×10 −49 ). Наоборот, ни один из регуляторных вариантов высокого риска не был в саркомерных генах.

КМП, кардиомиопатия; SNV, однонуклеотидный вариант; CNV, вариант номера копии; gnomAD, база данных агрегации геномов; ACMG, Американский колледж медицинской генетики; TFBS, сайт связывания фактора транскрипции; P/LP, патогенный или вероятно патогенный; LoF, потеря функции; ГКМП, гипертрофическая кардиомиопатия; ДКМП, дилатационная кардиомиопатия;

Варианты, кодирующие белок, в известных генах CMP

Кодирующие белок SNV и CNV описаны в дополнительных таблицах 3 и 4 .Большинство (64%) вариантов, кодирующих патогенный белок, находились в саркомерных генах, что представляло собой значительное обогащение по сравнению с другими категориями генов (биномиальное p = 3,16 × 10 -49 ). Случаи HCM имели более высокий выход вариантов, кодирующих патогенный белок, по сравнению с другими подтипами CMP с отношением шансов (OR) 3,14, 95% доверительными интервалами (CI) 1,77–5,57 (p = 1,22 × 10 -4 ). Следует отметить, что WGS обнаружил варианты, кодирующие патогенный белок, в 17/228 (7,5%) случаях, ранее пропущенных клиническим генетическим тестированием на основе панели, поскольку не все гены CMP захватываются коммерческими тестовыми панелями, и ни одна из генных панелей не исследует CNV 31 .

Влияние вариантов, кодирующих белок, на экспрессию генов-мишеней в миокарде

Уникальной особенностью нашего биобанка является доступ к образцам миокарда пациентов, перенесших операцию или трансплантацию сердца. Секвенирование РНК было выполнено в образцах миокарда ЛЖ от 35 секвенированных пациентов с CMP, чтобы подтвердить влияние LoF SNV и CNV на экспрессию генов. На рис. 2a-c показано, что экспрессия мРНК гена-кандидата была ниже 25 th процентиля в миокарде пациентов с LoF SNV ( DSC2, FLNC, MYBPC3 ) по сравнению с оставшейся когортой.Уровни экспрессии эндогенных генов также были снижены у пациентов с единичной делецией CNV, влияющей как на промотор, так и на первые экзоны генов JPh3 и NEXN , а также экзон 11 CTNNA3 (, рис. 2d-f ). Возможность показать влияние кодирующих вариантов на экспрессию эндогенного гена в органе-мишени является уникальным открытием, которое поддерживает использование миокарда пациента для подтверждения патогенности вариантов.

Рисунок 2: Влияние потери функции и количества копий в генах CMP на экспрессию миокардиальных генов.

На рисунке показана экспрессия миокардиального гена LV с использованием секвенирования РНК у пациента с потерей функции или делецией числа копий (красная точка) по сравнению с другими случаями без варианта (серые точки) (n = 35 случаев). ( ac ) На левых панелях показано положение аминокислот в трех патогенных вариантах потери функции в DSC2 (стоп-гейн), FLNC (сплайс-акцептор), MYBPC3 (делеция сдвига рамки считывания), которые, по прогнозам, приведут к нонсенс-опосредованному распаду. мРНК. Правые панели показывают масштабированную экспрессию RPKM целевой мРНК ниже 25 th процентиля по сравнению с оставшейся когортой; ( d-f ) На левых панелях показано геномное расположение трех одиночных делеций CNV в генах CTNNA3, JPh3, NEXN .Правые панели показывают масштабированную экспрессию RPKM целевой мРНК ниже 25 th процентиля по сравнению с оставшейся когортой.

RPKM, количество прочтений на килобазу транскрипта, на миллион картированных прочтений

Варианты LoF, кодирующие белок, в новых генах CMP

WGS предоставил нам возможность изучить новые биологически значимые гены помимо известных генов CMP в качестве потенциальных источников патогенных кодирующих вариантов . Мы провели поиск редких (gnomAD MAF<0,01%) предсказуемых вредных гетерозиготных и гомозиготных вариантов LoF в генах, участвующих в функции сердца с умеренно-высокой экспрессией сердца, которые считались ограниченными для вариантов LoF 32,33 .Используя эти критерии, мы идентифицировали редкие варианты LoF в 11 новых генах у пациентов с CMP, у которых не было варианта, кодирующего патогенный белок (5% когорты) (, дополнительная таблица 5, ). Исследование 1266 независимых пробандов CMP в когорте репликации 100000 Genomes Project выявило редкие гетерозиготные или гомозиготные варианты LoF в пяти из этих новых генов ( FHOD3, NRAP, PDE4DIP, PTGDS и TRPM4 ). FHOD3 содержал наибольшую долю вариантов LoF, при этом варианты были идентифицированы в пяти дополнительных случаях CMP из проекта 100 000 геномов, а не только в одном контрольном образце ICGC.

Из этих 11 генов мы исследовали FHOD3 и NRAP в качестве сильных кандидатов, поскольку известно, что они обладают высокой специфичной для сердца экспрессией 34,35 , важны для поддержания саркомерного и актинового цитоскелета в сердце , и были связаны с CMP в исследованиях на мышах и в небольших сериях случаев 36–43 . В нашей когорте мы обнаружили редкий вариант сдвига рамки FHOD3 у пациента с ДКМП и редкий гомозиготный вариант сдвига рамки считывания в NRAP у пациента с ДКМП, рожденного от близкородственных родителей.Интересно, что делеция сдвига рамки FHOD3 , наблюдаемая в нашей когорте, также была обнаружена в случае проекта 100 000 геномов (, дополнительная таблица 6 ). Распределение вариантов LoF в NRAP показано в Рисунок 3a и FHOD3 в Рисунок 3b для когорты обнаружения, когорты репликации 100 000 Genomes Project и gnomAD. Используя миокард ЛЖ от пациента с вариантом NRAP , мы подтвердили, что экспрессия мРНК NRAP (с использованием RNAseq и направленной qRT-PCR) и экспрессия белка (на вестерн-блоттинге) были значительно снижены у пациента, несущего этот вариант, по сравнению с другими Пациенты с CMP, у которых не было этого варианта (, рис. 3c, ).

Рисунок 3: Варианты с потерей функции в новых генах CMP:

Местоположение вариантов с потерей функции в ( a ) NRAP (ENST00000359988) и ( b ) FHOD3 (случаи CMPENST00

902) в когорта обнаружения (оранжевые точки) и 1326 случаев CMP в когорте репликации проекта 100 000 геномов (синие точки). Фоновая карта плотности вариантов gnomAD показана серым цветом. ( c ) Миокардиальная экспрессия NRAP : Анализ РНК-секвенции продемонстрировал низкую экспрессию мРНК NRAP (<75 th процентиль) в миокарде ЛЖ пациента с ДКМП, несущего гомозиготный вариант сдвига рамки считывания (chr10:1154011188)_T/T/T/T/T/T/T/T (красная точка) по сравнению с 34 пациентами с CMP без варианта (черные точки).Коробчатая диаграмма показывает медианное выражение для когорты, процентили 25 th и 75 th , а также нижнее и верхнее предельные значения. qRT-PCR подтвердил снижение экспрессии мРНК NRAP у пациентов с вариантом по сравнению с 2 пациентами CMP без варианта, т.е. WT (*p<0,05 по сравнению с WT). Вестерн-блоттинг подтвердил снижение экспрессии белка NRAP у пациента с вариантом по сравнению с 3 пациентами с CMP без варианта на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга (*p<0.05 против WT). ( d-g ) Эмбрионы рыбок данио Эмбрионам рыбок данио на стадии 1 клетки вводили 4 комплекса направляющей РНК CRISPR-Cas9, чтобы вызвать нокаут 2 генов, nrap и fhod3ab . ( d ) qRT-PCR показал снижение экспрессии мРНК-мишени на 35-49% в объединенных образцах мутантов nrap и fhod3ab по сравнению с контролями WT и контролями только Cas9 (n=3 независимых повтора на ген) (* *p<0,01 по сравнению с контролем). ( e ) 22% мутантов nrap и 26% мутантов fhod3ab показали аномальный сердечный фенотип по сравнению с 0% в контрольной группе только Cas9 (**p<0.01 по сравнению с элементами управления). ( f ) Конечно-систолическая площадь предсердий была выше, а конечно-диастолическая площадь желудочков была ниже у мутантов nrap и fhod3ab по сравнению с контрольной группой только дикого типа и Cas9 (**p<0,01 по сравнению с контрольной группой). ( g ) Репрезентативные фазово-контрастные изображения трансгенных эмбрионов myl7 :GFP, демонстрирующие кардиомегалию, дилатацию предсердий и рестрикцию желудочков у мутантных эмбрионов по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа или только Cas9. (**p<0,01 по сравнению с контролем). Масштабная линейка = 50 мкм.Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов на образец, причем каждый эксперимент включает 3 технических повторения.

gnomAD, База данных агрегации геномов; WT, дикий тип; mut, mutant

Эффект нокаута CRISPR-Cas9 новых генов у рыбок данио

Чтобы подтвердить роль этих новых генов в структуре и функции сердца in vivo , мы индуцировали направленный нокаут nrap и fhod3 у рыбок данио эмбрионам через инъекцию в желточный мешок наборов из 4 комплексов направляющей РНК (гРНК) CRISPR-Cas9, которые избыточно нацелены на один ген и индуцируют эффективный нокаут, что позволяет проводить быстрый скрининг функции гена 44,45 ( Рисунок 3d-g) .Секвенирование по Сэнгеру выявило большое количество вариантов с высокой эффективностью разрезания за счет 4 гРНК, нацеленных на экзоны nrap, fhod3a и fhod3b по сравнению с 0% в контрольных группах только Cas9 (, дополнительная фигура 1) . qRT-PCR показала 0,64-кратное подавление nrap и 0,4-кратное подавление fhod3a и fhod3b в эмбрионах, отредактированных CRISPR-Cas9, по сравнению с контролем (, рис. 3d, ). Фенотипический анализ выявил значительное увеличение предсердий у эмбрионов с отредактированными генами по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа или только Cas9 (p<0,0.01 по сравнению с контролем для всех генов) (, рис. 3e, ). Конечно-диастолическая площадь желудочков была значительно уменьшена у эмбрионов с отредактированными генами по сравнению с контрольными эмбрионами дикого типа или Cas9 (, рис. 3f-g ), но фракция выброса желудочка была сохранена (дикий тип 36±2%, Cas9 34±4%, ). мутанты nrap 37 ± 3% и мутанты fhod3ab 42 ± 2%), что свидетельствует о рестриктивном фенотипе CMP у эмбрионов с дефектами nrap и fhod3 . Вместе эти исследования подтверждают роль вариантов LoF в новых генах, таких как NRAP и FHOD3 , в возникновении CMP.

Регуляторные варианты генов CMP

Мы создали атлас функционально активных регуляторных элементов генов, экспрессирующихся в сердце, в геноме. Это было сделано путем картирования некодирующих областей в сердце человека, которые предположительно регулируют транскрипцию сердечно-активных генов, на основе экспериментальных данных, собранных из связанных с сердцем эпигенетических, ДНКазных и гистоновых данных ChIP-seq, депонированных в ENCODE и других базах данных 46. –49 . Мы определили промоторные области генов CMP путем слияния пиков DNase-seq открытых хроматиновых и гистоновых меток, специфичных для промоторов и энхансеров в тканях сердца.Там, где эта информация была недоступна, мы определяли промоторные области как 1,5 т.п.н. выше и 1 т.п.о. ниже сайта начала транскрипции (TSS). В этом исследовании мы сосредоточились на промоторах и энхансерах известных генов CMP, а не на всем геноме, чтобы избежать ложноположительных результатов, связанных с генами с неясной ассоциацией с CMP. Мы сопоставили SNV с активными регуляторными областями и определили их как уровень 1, если они были редкими, т.е. MAF <0,01% в контрольной популяции, и было предсказано изменение связывания фактора транскрипции (TF) по крайней мере с помощью 3 из 4 инструментов прогнозирования, которые предсказывают, если изменение последовательности влияет на вероятные эффекты TFBS или хроматина с чувствительностью к одному нуклеотиду 50–53 (см. Методы).

Кроме того, мы отдали приоритет вариантам, которые имели как минимум 1,3-кратное обогащение в случаях по сравнению с контролем, которые были в регуляторных элементах, активных в левом желудочке человека (ЛЖ), и которые наблюдались в случаях, ускользающих от генов (т. е. без патогенных варианты кодирования в генах CMP). Это дало окончательный приоритетный список из 52 вариантов уровня 1 высокого риска в 19% когорты (, рис. 4a, ). Два дополнительных пациента содержали CNV высокого риска в регуляторных элементах BAG3 и TGFB3 (дополнительная таблица 4) .Для анализа бремени случай-контроль мы использовали данные WGS от 1326 больных раком без болезней сердца из Международного консорциума генома рака (ICGC) 54 . Это подтвердило обогащение регуляторных вариантов в генах CMP в случаях по сравнению с контролем (ОШ 2,14, 95% ДИ 1,60–2,86, p = 5,26 × 10 -7 ) (, рис. 4b ). Дополнительная таблица 7 содержит подробные сведения о вариантах регулирования с высоким риском. Верхние 4 гена, значительно обогащенные регуляторными вариантами, находились в путях, связанных с (i) гликозилированием α-дистрогликана, важным для структуры саркомера i.е. FKTN (OR 53.2, CI 2.9-991) и DTNA (OR 5.6, CI 2.5-12.5), и (ii) десмосомная передача сигналов, т.е. DSC2 (OR 29.3, CI 1.4-611) и

DSG92 (OR 9.7, CI 1.2-74) ( Рисунок 4c ). Ни один из вариантов не был de novo среди пробандов с полными данными о трио. Дополнительные варианты-кандидаты уровня 1 в этих и других генах, важных для этих двух сигнальных систем, также описаны в таблице, хотя они не соответствуют всем критериям высокого риска.

Рисунок 4. Бремя вариантов регулирования в случаях (n=228) и контроле (n=1326).

( a ) Бремя регуляторных вариантов уровня 1 в генах CMP в случаях (оранжевый) и контроле (синий). В случаях наблюдалось значительное обогащение регуляторных вариантов уровня 1 по сравнению с контролем (ОШ 2,14, 95% ДИ 1,60–2,86, p = 5,26 × 10 -7 ). ( b ) Бремя регуляторных вариантов уровня 1 по генам в случаях в когорте открытия по сравнению с контролем. Топ-4 гена, обогащенных регуляторными вариантами по сравнению с контролем, включали FKTN (OR=53.2, ДИ = 2,9–991), DTNA (ОШ = 5,6, ДИ = 2,5–12,5), DSC2 (ОШ 29,3, ДИ 1,4–611) и DSG2 (ОШ 9,7, ДИ 1,2–74). ( c ) Когорта репликации (n = 1266): Точечная диаграмма показала положительную корреляцию между генами, обогащенными регуляторными вариантами высокого риска, в когорте открытия CMP и когорте репликации 100 000 Genomes Project (Spearman ρ 2 0,737, p = 1,02 ×10 -8 ) с верхними генами, сходными в обеих когортах CMP ( FKTN, DTNA, DSC2, DSG2 )

OR, отношение шансов

Мы распространили наш анализ на независимую когорту репликации из 1266 CMP пробанды с данными WGS из проекта 100 000 геномов.Наблюдалась положительная корреляция между когортами обнаружения и репликации для генов, обогащенных регуляторными вариантами высокого риска (ρ 2 0,737, p = 1,02 × 10 -8 Спирмена), при этом верхние гены были сходны в обеих когортах CMP (). FKTN, DTNA, DSC2, DSG2 ) с ОШ в диапазоне 3,14–13,7 (, рис. 4d, ).

Анализ обогащения путей

Сравнение путей, обогащенных кодирующими белками, с регуляторными вариантами было выполнено с использованием баз данных Gene Ontology и Reactome 55–57 .Варианты, кодирующие патогенный белок, были обогащены узким набором категорий генов, непосредственно связанных с сокращением мышц, включая связывание актина, тропонина С, кальмодулина и протеинкиназы (, дополнительная фигура 2а, ). Напротив, регуляторные варианты высокого риска были обогащены не только генами, участвующими в процессах, связанных с сокращением мышц, но также и в дополнительных разнообразных путях, связанных с передачей сигналов ERK/Ras, передачей сигналов рецептора фактора роста фибробластов и передачей сигналов тирозинкиназы (, дополнительная фигура 2b). ).В отличие от вариантов, кодирующих белок, ни один из регуляторных вариантов высокого риска не был обнаружен в саркомерных генах. Было только шесть генов ( DSC2, DSG2, JPh3, LAMP2, NEXN, PRKAG2 ), которые содержали варианты высокого риска как в кодирующих, так и в регуляторных областях.

Следует отметить, что высокая доля, т. е. 44 (19 %) случаев, содержала множественные кодирующие и/или регуляторные варианты в известных генах CMP, включая 5 % с множественными вариантами, кодирующими белок, 4 % с множественными регуляторными вариантами и 10 % с множественными вариантами кодирования. комбинация обоих типов вариантов ( рисунок 1d ).Множественные варианты у трети пациентов были в генах, важных для архитектуры миокарда, то есть в саркомерных, цитоскелетных, десмосомных и других структурных генах. Множественные варианты чаще встречались в случаях ГКМП по сравнению с другими подтипами КМП (OR=3,4, CI=1,7-6,6, p=5,75×10 -4 ).

Функциональная оценка регуляторных вариантов

Мы определили приоритет регуляторных вариантов уровня 1 в 6 генах ( BRAF, DSP, DTNA, FKRP, FKTN, LARGE1, PRKAG2, TGFB3) для функционального анализа на основе наличия левого желудочка (LV) миокарда от вариант-положительных пациентов. На рис. 5 показаны регуляторные варианты высокого риска, идентифицированные в этих восьми генах в нашей когорте исследователей и когорте проекта «100 000 геномов», наложенные на фон частотного распределения в базе данных агрегации геномов (gnomAD) эталонной популяции 33 . Большинство регуляторных локусов были лишены вариантов в gnomAD, что предполагает сильно ограниченные локусы. Дополнительная фигура 3 показывает изменение одного нуклеотида в интересующем варианте в нашей когорте открытий по сравнению с последовательностью дикого типа и прогнозируемое влияние на мотивы связывания TF 58 .

Рисунок 5: Геномное расположение вариантов в регуляторных элементах генов, приоритетных для функциональных исследований.

На рисунках показаны геномные координаты SNV в когорте открытия (n = 228, оранжевые точки) и когорте репликации 100 000 Genomes Project (n = 1266, синие точки), картированные относительно первой (P1) области промотора и сайта начала транскрипции. Для следующих генов ( A ) BRAF , ( B ) DSP , ( C ) DTNA , ( D ) FKRP , ( E ) FKTN f ) LARGE1 и к участкам энхансеров для ( g ) PRKAG2 (E15) и ( h ) TGFB3 (E1).SNV, наблюдаемые в эталонных образцах gnomAD, нанесены в виде кривых плотности серого по региону. Все регуляторные варианты наблюдались с частотой аллеля <0,01% в наборе данных gnomAD и имели тенденцию группироваться в регионах, которые были истощены для вариантов в gnomAD. Координаты основаны на эталонном геноме hg19.

gnomAD, База данных агрегации геномов

Ассоциация регуляторных вариантов с экспрессией миокардиального гена

Способность демонстрировать изменения в экспрессии миокардиального гена предоставляет важные доказательства влияния регуляторных вариантов на транскрипцию эндогенного гена.Экспрессию мРНК и белка измеряли с помощью RNAseq, qRT-PCR и Вестерн-блоттинга или иммуногистохимии у 35 пациентов, у которых был доступен миокард ЛЖ. Миокардиальную экспрессию сравнивали у пациента, несущего вариант, с контрольной группой без CMP или с пациентами с CMP, не имеющими варианта.

Мы оценили варианты промотора в BRAF, DSP, FKTN и LARGE1 проксимальнее соответствующей TSS, которые, как было предсказано, изменяют связывание TF. По сравнению с контрольной группой и/или вариантно-отрицательными пациентами с CMP мРНК BRAF показали 0.76-кратное подавление в qRT-PCR у пациента, несущего вариант промотора (chr7:140624223_G/A) (, рис. 6a, ). Вариант DSP (chr6:7541776_G/A) ассоциировался с более высокой экспрессией DSP в миокарде как при секвенировании РНК (выше 75 -го процентиля для когорты), так и при qRT-PCR (1,6-кратная активация) ( Рисунок 6b ). Вариант промотора FKTN (chr9:108320330_G/A) ассоциировался с более низкой экспрессией FKTN у пациента с RCM на RNAseq, на qRT-PCR (0.5-кратное подавление) и на вестерн-блоттинге (0,24-кратное подавление) (, фигура 6c, ). У пациента с ГКМП, несущего вариант промотора LARGE1 (chr22:34316416_C/T), иммуногистохимия показала снижение экспрессии перинуклеарного белка LARGE1 у пациента по сравнению с контрольной группой (, рис. 6d, ). Вариант энхансера PRKAG2 (chr7:1513

_A/C), обнаруженный у пациента с ДКМП, был связан с 1,4-кратной активацией при количественной ОТ-ПЦР и 1,5-кратной активацией при Вестерн-блоттинге в миокарде пациента (, рис. 6e, ).Экспрессия TGFB3 в миокарде у пациента с ОКМ с вариантом энхансера высокого риска (chr14:76289218_A/G), который, по прогнозам, взаимодействует с промотором TGFB3 48 , была связана с более высокой экспрессией мРНК на РНК-seq, 4,2-кратной повышающей регуляцией мРНК на qRT-PCR и 1,5-кратная активация белка TGFB3 на вестерн-блоттинге по сравнению с контролем (, рис. 6f, ). Эти результаты, полученные непосредственно из миокарда пациентов, несущих интересующие варианты, подтвердили, что SNV в ключевых регуляторных элементах связаны с важным влиянием на продукты функциональных генов и предоставляют важные подтверждающие доказательства патогенности вариантов.

Рис. 6. Экспрессия целевого гена и белка в миокарде ЛЖ у пациентов с регуляторными вариантами.

RNA Seq, qRT-PCR, Вестерн-блоттинг и иммуногистохимия были выполнены в доступном миокарде ЛЖ от пациентов с CMP (n = 35) для обнаружения экспрессии мРНК и белка генов-мишеней у пациентов, несущих регуляторные варианты в BRAF, DSP, FKTN, LARGE1 , ПРКАГ2 или ТГФБ3 . Что касается данных секвенирования РНК, экспрессию целевого гена RPKM в масштабе сравнивали между пациентом, имеющим вариант (красная точка), и остальной частью когорты (черные точки) с использованием ящичковых диаграмм, показывающих медиану экспрессии для когорты, 25 th и 75 th процентиля, а также максимальное и минимальное значения (n=35).Для qRT-PCR, Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии экспрессию целевого гена или белка в миокарде ЛЖ пациента, несущего вариант, сравнивали с контролем дикого типа, включая образец вскрытия человека без сердечного заболевания, а также один или несколько CMP. пациентов, у которых не было известных патогенных кодирующих или регуляторных вариантов. На образец проводили три независимых эксперимента, каждый из которых включал три технических повтора на образец. Уровень экспрессии белка GAPDH в качестве гена домашнего хозяйства использовали в качестве контроля загрузки для Вестерн-блоттинга.Столбики погрешностей указывают стандартное отклонение между средними значениями каждого независимого эксперимента. ( a ) BRAF : вариант промотора chr7:140624223_G/A ассоциировался с нормальной экспрессией мРНК BRAF на RNAseq, но снижал экспрессию мРНК BRAF на qRT-PCR. Вариант промотора chr7:140624286_C/T ассоциировался с повышенной экспрессией мРНК на RNAseq (>75 th процентиль). ( b ) DSP : вариант промотора (chr6:7541776_G/A) был связан с повышенной экспрессией мРНК DSP на RNAseq (>75 th процентиль) и на qRT-PCR (*p<0.05 против контроля). ( c ) FKTN : вариант промотора 1 (chr9:108320330_G/A) ассоциировался со сниженной экспрессией мРНК FKTN на RNAseq (<75 th процентиль), сниженной экспрессией мРНК на qRT-PCR (p<0,05 по сравнению с контролем), снижение экспрессии белка на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга и снижение относительного содержания белка при количественном определении (*p<0,05 по сравнению с контролем). ( d ) LARGE1 : Вариант промотора chr22:34316416_C/T ассоциировался с более низким перинуклеарным окрашиванием для LARGE1 (коричневый) (ядерное окрашивание, синий) на репрезентативных иммуногистохимических изображениях и более низким % LARGE1-положительных клеток в миокарде пациента (* р<0.05 против контроля). В качестве отрицательного контроля использовали ткань тимуса. Масштабная линейка = 20 мкм. ( e ) PRKAG2 : вариант энхансера chr7:1513

_A/C ассоциировался с нормальной экспрессией мРНК PRKAG2 на RNAseq, но более высокой экспрессией мРНК на qRT-PCR (*p<0,05 по сравнению с контролями), более высокой экспрессией белка на Western репрезентативные изображения блотов и более высокая относительная экспрессия белка при количественном определении (*p<0,05 по сравнению с контролем). ( f ) TGFB3 : вариант энхансера (chr14:76289218_A/G) был связан с более высокой экспрессией мРНК TGFB3 на RNAseq, более высокой экспрессией мРНК на qRT-PCR (*p<0.05 по сравнению с контролем), более высокая экспрессия белка на репрезентативных изображениях вестерн-блоттинга и более высокое относительное содержание белка при количественном определении (*p<0,05 по сравнению с контролем).

RNA Seq, секвенирование РНК; WT, дикий тип

Влияние регуляторных вариантов на транскрипцию генов с использованием репортерных анализов
Репортерный анализ люциферазы

Промоторы гена или энхансер+промоторы, содержащие кандидатные SNV, и соответствующая контрольная область были клонированы в репортерах люциферазы Firefly и трансфицированы в индуцированные человеком плюрипотенты кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (iPSC), для определения влияния вариантов на транскрипционную активность репортерного гена люциферазы (, дополнительная фигура 4a ).Клонированные промоторные варианты BRAF (chr7:140624223_G/A), DTNA (chr18:32072866_A/G), FKRP (chr19:47249754_C/T), FKTN:913,99819 (chr19:9810) 108320330_G/A) и LARGE1 (chr22:34316416_C/T) снижали активность люциферазы по сравнению с эталонными последовательностями. В варианте промотора DSP ( CHR6: 7541776_G / A ) , второй вариант промотора Bard1 ( CHR22: 34316687_G / A ) , а также вариант Enhancer TGFB3 (CHR14: 76289218_A / G) значительно повышенная активность люциферазы по сравнению с эталонными последовательностями (, фигура 7a, ).Измененная регуляция транскрипции репортера люциферазы за счет вставки промоторных и энхансерных вариантов нескольких генов CMP предполагает прямое регулирующее влияние этих SNP на транскрипцию гена-мишени.

Рис. 7: Репортерные анализы человеческих иПСК-кардиомиоцитов.

( a ) Репортерный анализ люциферазы, показывающий влияние регуляторных вариантов на транскрипцию. Клонированные промоторные варианты BRAF (chr7:140624223_G/A), DTNA (chr18:32072866_A/G), FKRP (chr19:47249754_C/T), FKTN:913,99819 (chr19:9810) 108320330_G/A) и LARGE1 (chr22:34316416_C/T) снижали активность люциферазы по сравнению с эталонными последовательностями.В варианте промотора DSP ( CHR6: 7541776_G / A ) , второй вариант промотора Bard1 ( CHR22: 34316687_G / A ) , а также вариант Enhancer TGFB3 (CHR14: 76289218_A / G) значительно повышенная активность люциферазы по сравнению с эталонными последовательностями. *p<0,05 по сравнению с эталонной последовательностью. Все репортерные анализы люциферазы проводили с 3 биологическими повторами, каждый с 3 техническими повторами. ( b ) График вулкана, показывающий влияние 54 регуляторных вариантов на экспрессию генов с использованием MPRA.29 вариантов имели значительные различия в транскрипционной активности между эталонным и альтернативным аллелями (FDR<0,05, представлено горизонтальной черной линией). Серый = активность варианта CMP ниже, чем у эталонного аллеля; черный = активность варианта CMP выше, чем эталонного аллеля. ( c ) 66% значимых вариантов были связаны с более высокой транскрипционной активностью эталонного аллеля. ( d ) Log2-кратные изменения транскрипционной активности между последовательностями альтернативных и эталонных аллелей.( e ) Репрезентативные графики количества MPRA альтернативного аллеля (зеленый) по сравнению с последовательностями эталонного аллеля (серый) BRAF (chr7:140624223_G/A), DSP (chr6:7541468_T/C) и DTNA (chr18:32073296_C/G). Все анализы MPRA проводили в 5 независимых биологических повторностях.

MPRA, массово-параллельный репортерный анализ; ref seq, последовательность эталонного аллеля; FDR, частота ложных открытий; CMP, кардиомиопатия

Массивно-параллельный репортерный анализ (MPRA)

Для оценки функционального эффекта дополнительных регуляторных вариантов уровня 1 на транскрипционную активность мы использовали MPRA с более высокой пропускной способностью в кардиомиоцитах 22,23 .В частности, мы проверили регуляторные эффекты 54 вариантов, разделив транскрипционную активность их эталонных и альтернативных аллелей (каждый аллель представлен 25 уникальными штрих-кодами, см. Методы) в иПСК-кардиомиоцитах PGP17 (n = 5 независимых повторов) (, дополнительная фигура 4b). -e, дополнительная таблица 8 ). Из 54 исследованных вариантов 29 вариантов (54%) показали значительные различия в транскрипции между двумя аллелями [Коэффициент ложных открытий (FDR) <0,05] ( Рисунок 7b , c ) с логарифмическим 2-кратным изменением в диапазоне от -2.от 72 до +2,23 (, рис. 7d, дополнительная таблица 8, ). Это представляло 26 дополнительных вариантов с высокой регуляторной активностью помимо тех, которые были подтверждены в предыдущих анализах репортеров миокарда и люциферазы. Репрезентативные примеры подсчета MPRA демонстрируют высокую регуляторную активность вариантов в локусах BRAF, DSP и DTNA (, рис. 7e, ). В целом результаты MPRA подтверждают, что наш WGS уверенно идентифицировал варианты, которые функционально активны в кардиомиоцитах.

Таким образом, наши результаты с использованием WGS выявили значительный вклад регуляторных вариантов и CNV в гены CMP (в 20% случаев) и небольшой, но заметный вклад вариантов, кодирующих белок LoF, в новые гены (еще в 5% случаев). случаев) к детскому началу CMP.

ОБСУЖДЕНИЕ

WGS дает большое количество вариантов, кодирующих белок зародышевой линии, и регуляторных вариантов. Пониманию их вклада в болезни человека препятствует отсутствие строгой биоинформатики и функциональных подходов, адаптированных к изучаемому заболеванию.Используя WGS в CMP, мы идентифицировали вредные варианты, кодирующие белок, у 36% нашей когорты, включая 7,5%, которые были пропущены, несмотря на клиническое тестирование генов-кандидатов. Кроме того, мы обнаружили 5% пациентов с вредными вариантами в новых генах CMP и, что очень важно, еще 20% с регуляторными вариантами высокого риска, о которых ранее не сообщалось в CMP. Было подтверждено, что важное подмножество этих регуляторных вариантов влияет на экспрессию экзогенных и эндогенных генов в функциональных анализах, тем самым предоставляя убедительные доказательства их вклада в CMP.Открытие и проверка этих новых вариантов уменьшили вдвое количество случаев CMP, неуловимых генами, в нашей когорте.

Из новых генов, содержащих вредные варианты, кодирующие белок, два гена, NRAP и FHOD3 , оказались сильными кандидатами. Оба важны для поддержания саркомерного и актинового цитоскелета в сердце и были связаны с CMP в исследованиях на мышах и в небольших сериях случаев 36-43,59,60 . Наш пробанд был гомозиготен по варианту LoF в NRAP , подобно ранее описанной семье с аутосомно-рецессивным фенотипом DCM 39 .Более того, в нашей когорте репликации также было обнаружено большое количество вариантов этих генов. Сниженная экспрессия NRAP в миокарде пациентов в сочетании со сниженной экспрессией nrap и fhod3 и фенотипом CMP у рыбок данио с нокаутом обеспечивает подтверждающие доказательства того, что NRAP и FHOD3 являются новыми генами, которые следует рассматривать как сильные гены-кандидаты для клинического тестирования при CMP.

Чрезвычайно захватывающим открытием нашего исследования было обогащение сильнодействующих регуляторных SNV и CNV в случаях по сравнению с контролем, при этом 20% случаев содержали эти варианты в периодически мутировавших областях, активных в ЛЖ человека.При анализе по подтипу CMP выход регуляторных вариантов высокого риска был выше в CMP без HCM, в которых варианты, кодирующие белок, составляют лишь небольшую часть случаев. В целом регуляторные варианты были обогащены не только путями, связанными с мышечным сокращением, но также связыванием α-дистрогликана, передачей сигналов десмосом и передачей сигналов ERK/Ras. Хотя кодирующие варианты в этих путях обычно вызывают мультисистемное вовлечение, мы не наблюдали системных особенностей у пациентов, несущих некодирующие варианты в этих генах.Возможно, эффект регуляторных вариантов ограничен сердцем, в отличие от кодирующих вариантов, влияющих на функцию белка во многих тканях. Кроме того, саркомерные гены менее подвержены влиянию регуляторных вариантов, вероятно, потому, что они более устойчивы к гапло-недостаточности.

Примечательный набор генов с нерегулируемой экспрессией включает DTNA, FKTN, FKRP, LARGE1 и POMT , которые необходимы для функции α-дистрогликана посредством посттрансляционного гликозилирования.Дистрогликан является центральным компонентом комплекса дистрофин-гликопротеин, где он функционирует как трансмембранный линкер, прикрепляющий цитоскелет к внеклеточному матриксу и играющий роль в стабильности миоцитов, сарколеммы и саркомеров 61,62 . Нарушение гликозилирования ассоциировано с тяжелой сердечной дисфункцией у FKTN или LARGE1-дефицитных мышей и с DCM (с легким поражением скелетных мышц или без него), часто в контексте гомозиготных или составных гетерозиготных вариантов 63-65 .Мы также обнаружили обогащение регуляторных вариантов, нарушающих экспрессию десмосомных генов ( DSG2, DSC2, JUP, DSP ), в которых варианты миссенс и LoF, как сообщалось, вызывают AVC, DCM и RCM, подобно пациентам в нашей когорте . 66 .

Сильной стороной нашего исследования была возможность функционально подтвердить влияние регуляторных вариантов на экспрессию генов и белков. Мы подтвердили, что активность репортерного гена люциферазы была изменена под действием вариантов последовательностей промотора/энхансера по сравнению с контролем дикого типа в кардиомиоцитах человека 67,68 .Мы признаем, что репортерные анализы люциферазы не способны оценивать регуляторные варианты, влияющие на структуру хроматина. Однако мы определили промоторы генов CMP путем слияния пиков DNase-seq открытых хроматиновых и гистоновых меток, специфичных для промоторов и энхансеров, полученных из сердечной ткани. Более того, мы смогли показать, что экспрессия эндогенных генов была изменена в миокарде ЛЖ пациентов, несущих эти варианты, что является поистине уникальной силой нашего исследования. Например, повышенная экспрессия миокардиального TGFB3 наблюдалась у пациентов с ДКМП или ГКМП, но это первый случай варианта регуляторного элемента этого гена, связанного с повышенной экспрессией TGFB3 в миокарде пациентов 69,70 .Сходным образом, насколько нам известно, это первое сообщение о сниженной экспрессии генов-мишеней в миокарде пациентов, несущих варианты промотора уровня 1, а также тех, которые содержат CNVs, включающие гены-кандидаты CMP 71-74 . Важно отметить, что с помощью MPRA мы смогли продемонстрировать значительный регулирующий эффект большего подмножества вариантов высокого риска, связанных с этими генами, что усилило силу нашей стратегии отбора вариантов 75–78 . Вместе эти находки не только представляют собой важный прогресс в нашем понимании сердечного регулома, но также обеспечивают новое понимание геномной архитектуры CMP у детей и дополняют открытие некодирующих вариантов при заболеваниях человека 21 .

Как и в предыдущих отчетах, мы обнаружили несколько вариантов кодирования в 5% случаев, которые, как сообщалось, способствуют более тяжелому фенотипу 79 . В нашей когорте мы также смогли обнаружить одновременное появление не только кодирующих SNV, но и CNV. Два пациента с ГКМП, один с патогенным MYBPC3 SNV и MYOM1 CNV, умерли, а другой с вариантом сайта сплайсинга LoF в FLNC и делецией CNV в CTNNA3 потребовали трансплантации сердца в течение первого года жизни. .Особенно интригующим открытием нашего исследования было то, что до 14% случаев содержали несколько регуляторных вариантов высокого риска, иногда в сочетании с патогенным кодирующим вариантом. Все эти варианты были обнаружены в генах, важных для структуры миоцитов. Необходимы дальнейшие исследования для изучения связи множественных регуляторных вариантов с тяжестью заболевания.

Роль регуляторных вариантов могла быть недооценена в нашем исследовании, поскольку мы не исследовали дистальные энхансеры. Кроме того, TFBS, которые не напоминают консенсусную последовательность, могли быть ошибочно классифицированы как не относящиеся к группе высокого риска.Поскольку прогнозы in silico со временем улучшаются, это позволит более широко исследовать регулом вариантов заболеваний. Наконец, мы были ограничены в нашей способности оценивать экспрессию эндогенных генов из-за небольшого количества доступных образцов миокарда.

В целом, наши выводы о том, что варианты с высокой достоверностью, идентифицированные с использованием моделей прогнозирования in silico , имеют функциональные последствия, подтверждают наш биоинформатический подход к открытию новых вариантов и дают веские основания для изучения вариантов в периодически мутировавших цис-регуляторных элементах генов CMP, чтобы повысить доходность генетического тестирования 80,81 .Таким образом, наша работа представляет собой руководящую стратегию для решения регуляторных вариантов при сердечных заболеваниях и подчеркивает необходимость дальнейших исследований для подтверждения клинической полезности этих результатов.

МЕТОДЫ

Изучаемая когорта

Исследовательская когорта включала неродственные случаи первичного индекса CMP в возрасте до 21 года на момент постановки диагноза, а также больных и здоровых членов семьи, набранных в период с 2007 по 2018 год через биобанк Кардиологического центра в больнице для больных детей, Торонто 80 .HCM, DCM, RCM, LVNC и AVC были диагностированы на основании опубликованных клинических критериев 82,83 . Из исследования были исключены пациенты с вторичными КМП, возникшими в результате врожденных нарушений метаболизма, митохондриальных нарушений, синдромальной и нервно-мышечной этиологии. Были собраны клинические данные, включая демографические данные, диагноз, семейный анамнез, результаты клинического генетического тестирования и исходы во время наблюдения. Средний возраст на момент постановки диагноза составил 2,8 года (от 0 до 20 лет), 42% женщин. Основные этнические группы, по самоотчетам, составляли 71% белых, 17% азиатов, 6% черных.26% случаев были положительными по генотипу при предыдущем клиническом панельном тестировании, 47% были отрицательными по генотипу и 27% клинически не тестировались. Десять случаев (4,7%) умерли, и 130 случаев (57%) испытали серьезное неблагоприятное сердечное событие при последующем наблюдении ( Supplementary Table 1 ). Сбор и использование ДНК человека и ткани миокарда из случаев CMP через Реестр биобанков сердечного центра были одобрены Институциональными советами по этике исследований (Больница для больных детей, Детская больница Восточного Онтарио, Больница общего профиля Торонто, Лондонский центр медицинских наук, Кингстонская больница общего профиля). , и Центр медицинских наук Гамильтона) и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и/или их родителей/законных опекунов 80,81 .

Полногеномное секвенирование (WGS)

WGS было выполнено на высококачественной ДНК из крови или слюны для достижения как минимум 30-кратного охвата с использованием платформы Illumina HiSeq X через Macrogen, Южная Корея, и Центр прикладной геномики (TCAG, Больница для больных детей, Торонто). Высококачественные прочтения парных концов (2×150 п.н.) были сопоставлены с эталонной последовательностью генома человека (hg19) с использованием выравнивателя Isaac, и варианты были названы с использованием вызывающего устройства Isaac 84 . Метрики качества WGS рассчитывались с помощью mosdepth (https://github.com/brentp/mosdepth) 85 . Образцы со средним полногеномным покрытием менее 10X исключались из дальнейшего анализа. Варианты, соответствующие метрикам качества вызывающего абонента варианта Isaac по умолчанию, были аннотированы с использованием snpEff (v.4.3) 86 и annovar (v.2016.02.01) 87 . Варианты, используемые для последующего анализа, также должны были иметь флаг «PASS» в поле «FILTER». Кроме того, от SNV требовалось, чтобы общая глубина отфильтрованного чтения (‘DP’) была ≥ 10X, в то время как для вставок дополнительно требовалось, чтобы общая глубина отфильтрованного чтения в позиции, предшествующей вставке (‘DPI’), была ≥ 10X.Общее количество SNV на образец было рассчитано с использованием bcftools 88 .

Варианты кодирования белка в генах CMP

Извлекая данные из онлайн-базы данных Mendelian Inheritance in Man (OMIM), различных коммерчески доступных панелей генов CMP, отобранных вручную из литературы, мы составили первичный список из 133 генов-кандидатов, тесно связанных с CMP ( Дополнительная таблица 2 ). Митохондриальные гены были исключены. Мы разработали вычислительные рабочие процессы для интерпретации SNV (миссенс, сплайсинг, LoF), вставок и CNV в кодирующих и некодирующих областях.

Белковые кодирующие SNV и вставки

Мы разработали пользовательский рабочий процесс классификации вариантов для идентификации патогенных белковых кодирующих SNV и сайтов сплайсинга на основе рекомендаций ACMG 2015 24 . Конвейер автоматической классификации вариантов был основан на информации из различных источников, включая ClinVar 89 и Базу данных мутаций генов человека (HGMD) 90 , для определения ранее зарегистрированных патогенных или вероятно патогенных вариантов. 1000 геномов 91 , NHLBI-ESP 92 , Exome Aggregation Consortium (ExAC) и база данных агрегации геномов (gnomAD) использовались в качестве эталонных элементов управления для фильтрации редких вариантов, определенных как MAF <0.01% 93 . Патогенность вариантов пробирки прогнозов было предсказано с использованием результатов прогнозирования по крайней мере из пяти инструментов прогнозирования, включая SIFT 94 , Polyphen2 95 , MutationTaster2 96 , Mutation Assessor 97 , CADD 27 , Provan 25 , филогенетический P- значение из пакета PHAST для множественного выравнивания 99 геномов позвоночных с геномом человека (phyloP100way_vertebrate) 98 , MetaSVM и MetaLR 26 . Показатель сохранения генома был получен из GERP++ 99 и phastCons 12 .Предполагаемые варианты укорочения белка, которые, по прогнозам, вызывают потерю функции, включая сайты сплайсинга, бессмысленные варианты и варианты сдвига рамки считывания, были оценены и аннотированы с использованием инструмента LOFTEE (https://github.com/konradjk/loftee) в качестве плагина через Ensembl’s Variant Effect Predictor (VEP). v90) инструмент 100 . Патогенность вариантов, выявленных при клинических испытаниях, по возможности была подтверждена с использованием классификаций ClinVar 89 и InterVar 101 . Сегрегацию и анализ de novo проводили для всех вариантов, когда были доступны WGS от членов семейства.SNV и индели в генах CMP, которые соответствовали критериям патогенности, описанным выше, и которые дополнительно имели MAF<0,01% в эталонной популяции gnomAD v2.1.1, считались причинными для CMP. Эти вероятные причинно-следственные варианты были рассмотрены и подтверждены независимой классификацией лабораторией молекулярно-генетического тестирования учреждения, и все зарегистрированные SNV были подтверждены с использованием секвенирования по Сэнгеру, где это было возможно.

Белковые кодирующие CNV

Для вызова CNV используются два алгоритма на основе глубины считывания, ERDS v1.1 (оценка по глубине считывания с SNV) 102 и CNVnator v0.3.2 103 использовались, как описано ранее 29 . Идентифицированные области CNV были аннотированы с использованием пользовательского конвейера аннотаций, разработанного в TCAG. Чтобы повысить достоверность вызовов, в последующие анализы были включены только области CNV размером >1 т.п.н. с не менее чем 50% реципрокным перекрытием между вызовами ERDS и CNVnator и <70% перекрыванием теломер, центромер и сегментарных дупликаций. Редкие CNV были определены как варианты, встречающиеся с частотой < 1% в более чем 1500 контрольных образцах родительских образцов из когорты аутистов, MSSNG 18 .Используя карту CNV генома человека 30 , события CNV, перекрывающие области CNV, которые были склонны к количеству копий <30%, были приоритетными для последующего анализа. Редкие CNV размером > 1 КБ, влияющие на кодирующие экзоны, были проверены вручную с использованием считываний из файлов BAM и дополнительно проверены с использованием количественной ПЦР со 100% соответствием. Пациентов, у которых не было хотя бы одного причинного варианта (т. е. редкого, кодирующего белок патогенного SNV или CNV в генах CMP), считали неуловимым геном, и их дополнительно оценивали на наличие кодирующих белок вариантов в новых генах и регуляторных элементах известного CMP. гены.

Анализ вариантов De novo

Полные трио родитель-потомок были доступны в 22 случаях. Чтобы идентифицировать варианты de novo, мы создали полный рабочий процесс набора инструментов для анализа генома (GATK)/v4.1.2.0 передовой практики 104 локально для совместного вызова коротких вариантов (SNV и indels) в нашей когорте. Необработанные чтения с парными концами сначала обрезали и очищали с помощью trimmomatic v.0.32, а затем картировали с эталонным геномом человека GRCh47 для каждого образца с использованием bwa v.0.7.15. Эталонная последовательность генома и обучающий набор данных были загружены с сайта пакета GATK (ftp.wideinstitute.org/bundle/b37). Сопоставленные чтения были повторно выровнены и откалиброваны с помощью инструментов повторной калибровки базовой оценки качества (BQSR). HaplotypeCaller использовался для создания файлов генотипа VCF (gVCF) для каждого образца. Наконец, файлы gVCF для всех образцов были объединены и объединены с помощью инструментов CombineGVCFs и GenotypeGVCFs. Чтобы отфильтровать вероятные артефакты в вызовах, SNP и вставки были перекалиброваны отдельно с помощью инструментов повторной калибровки показателя качества вариантов (VQSR) и вариантов, которые прошли уровень чувствительности к истине VQSR 99.5 для SNP и уровень 99,0 для вставок были сохранены. Мы развернули рабочий процесс уточнения GATK для выявления вариантов de novo, которые считались патогенными или вероятно патогенными по критериям ACMG. Чтобы сделать вывод о возможных сайтах de novo с высокой степенью достоверности, мы сначала пересчитали вероятности генотипов образцов в масштабе phred, введя набор вызовов проекта 1000 Genomes (1000G_phase3_v4_20130502) и родословные трио. Эти дополнительные данные можно использовать в качестве предварительных знаний для повторной калибровки достоверности генотипов, а не только для расчета вероятности генотипа образца только по его прочтению.На этом этапе был применен инструмент CalculateGenotypePosteriors. Затем мы использовали VariantFiltration, чтобы отметить сайты с низким качеством генотипа (GQ), у которых значения GQ были ниже 20 и глубина считывания были ниже 10. Наконец, только сайты со всеми числами трио ≥ GQ 20 были определены как сайты с высокой достоверностью de novo. вариантов в конечном наборе вызовов.

Варианты LoF, кодирующие белок, в новых генах CMP

Чтобы идентифицировать новые предполагаемые гены CMP помимо 133 установленных генов CMP, мы провели поиск предполагаемых вредных гетерозиготных и гомозиготных вариантов LoF (т.е. сдвиг рамки считывания, бессмыслица, стоп-уровень, стоп-лосс и варианты сплайсинга) в оставшейся части экзома среди случаев CMP, которые действительно содержат кодирующий патогенный белок или регуляторный вариант высокого риска в гене CMP. Варианты LoF были идентифицированы с помощью LOFTEE (https://github.com/konradjk/loftee) 32,33 . Все варианты LoF должны были быть предсказаны как сильно воздействующие на VEP 100 , наблюдаемые с частотой аллеля <0,01% в эталонной популяции gnomAD, наблюдаемые у <1% неродственных семей в когорте и влияющие на гены, которые экспрессируются в человеческое сердце.Варианты получали дополнительный приоритет, если они находились в сильно ограниченном гене (gnomAD pLI>0,9) и/или были важны для функции сердца. Категории уровня экспрессии генов в тканях были получены из Атласа белков человека (http://www.proteinatlas.org) 35 .

SNV и CNV в регуляторных элементах генов CMP

На основании экспериментальных данных и данных Энциклопедия элементов ДНК (ENCODE), проект 47 , проект FANTOM 46 , эпигеномика дорожной карты 49 и опубликованные данные Dickel et al. 48 .Промоторные области всех генов CMP, не включенных Dickel et al., были определены как 1,5 т.п.о. выше и 1,25 т.п.о. ниже сайта начала транскрипции (TSS). TSS для канонических транскриптов и, при необходимости, транскриптов сердца в сборке 37 генома человека (hg19) были загружены из обозревателя генома Ensembl (www.ensembl.org — по состоянию на октябрь 2017 г.). Для выявления SNV риска в пределах определенных регуляторных областей генов CMP был разработан и реализован автоматизированный пользовательский конвейер приоритизации некодирующих вариантов.Вкратце, варианты внутри определенных регуляторных областей были аннотированы с использованием Ensembl’s Variant Effect Predictor (VEP v90) 100 . Варианты, перекрывающие известные регуляторные функции Ensembl, сравнивали с вариантами, идентифицированными в данных WGS в эталонных популяциях в gnomAD (n = 141 456). Регионы регулирования перечислены в дополнительной таблице 9 . Функциональное влияние редких регуляторных вариантов оценивали на основе показателей создания или разрушения TFBS. Оценки разрушения TFBS (потеря мотива) и создания TFBS (приобретение мотива) были основаны на комбинированных оценках прогнозирования из четырех различных инструментов — RegulomeDB 50 , motifbreakR 51 , DeepSEA 52 и Fathmm-MKL 105 .Варианты считались уровнем 1 и оценивались как наносящие ущерб по меньшей мере 3 из 4 инструментов прогнозирования (уровень 1). Регуляторные варианты получали дополнительный приоритет, если они встречались в случаях CMP с неуловимым геном, были связаны с геном, имеющим OR> 1,3 по сравнению с контрольной когортой ICGC, и находились в области, которая активна в LV человека. Межгенные и интронные CNV, а также индели <1 т.п.н., перекрывающиеся промотор и энхансеры, активные в развивающемся и взрослом сердце человека, как определено Dickel et al. 48 , также были приоритетными.

Анализ бремени регуляторных вариантов «случай-контроль»

Вызовы вариантов WGS были получены от 1326 пациентов без заболеваний сердца, зарегистрированных в Международном консорциуме генома рака (ICGC) 54 . Образцы WGS были получены из нормальной ткани, 998 из которых состояли из крови, 224 — из солидной ткани из участка, удаленного от первичной опухоли, 76 — из прилегающей солидной ткани и 28 — из других тканей. Пациенты включали 579 женщин и 747 мужчин; диагнозы включали 286 случаев рака поджелудочной железы, 221 рак головного мозга, 178 случаев рака предстательной железы, 123 рака молочной железы, 98 случаев рака пищевода, 82 рака печени, 74 рака почек, 70 случаев рака кожи, 68 случаев рака яичников, 64 рака костей, 37 случаев рака желудка, 13 случаев рака полости рта, и 12 случаев рака желчевыводящих путей.Данные были получены из раздела Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes (PCAWG) портала данных ICGC. Образцы были согласованы с hs37d5 (GRCh47), и вызовы вариантов зародышевой линии были сделаны с использованием конвейера вызовов вариантов DKFZ/EMBL. «НОРМАЛЬНЫЕ» выборочные вызовы были извлечены и отфильтрованы способом, сравнимым с когортой обнаружения: для последующего анализа использовались только варианты с флагом «ПРОШЕЛ», охватываемые не менее чем 10 считываниями (DP/DPI ≥10). Вариантные вызовы были преобразованы в hg19 с помощью Picard LiftoverVcf (http://broadinstitute.github.io/picard/).

Чтобы сравнить бремя вариантов между случаями и контролем для вариантов уровня 1 в регуляторных элементах генов CMP, требовалось, чтобы вызовы вариантов имели частоту аллеля ≤0,01% в gnomAD. Варианты, наблюдаемые в ≥1% образцов в исследуемой когорте, были исключены из нагрузочного тестирования, чтобы уменьшить количество ложноположительных вызовов вариантов. Для каждого сравнения (гена, пути или всего регулома) рассчитывали ОШ как частоту случаев по сравнению с контролями, содержащими по крайней мере один вариант.P-значения были рассчитаны с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Порог частоты ложных открытий (FDR) 0,2 был применен после удаления тестов, в которых не наблюдалось никаких вариантов в объединенных образцах случая и контроля. Чтобы уменьшить погрешность в этих расчетах и ​​избежать «нулевых ячеек» в таблицах непредвиденных обстоятельств, к каждой наблюдаемой частоте было добавлено 0,5 (поправка Холдейна-Анскомба). Все статистические анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения R версии 3.5.1.

Когортный анализ репликации

Анализ бремени нормативных вариантов был расширен на независимую когорту из 1266 случаев CMP с использованием образцов из проекта 100 000 геномов, доступных нам через Партнерство по клинической интерпретации Genomics England из версии 8 основной программы 106 .Все случаи должны были быть пробандами с доступными данными WGS и иметь по крайней мере один нормализованный термин конкретного заболевания, соответствующий «кардиомиопатии». Лица с дополнительными синдромальными терминами онтологии фенотипа человека (HPO) были исключены. Когорта включала 745 подтипов HCM, 355 DCM, 43 LVNC и 119 подтипов AVC; 22% на момент постановки диагноза были моложе 21 года; 62% были мужчинами, 82% были европейского происхождения. Там, где это было возможно, после выравнивания с эталонным геномом hg38 были получены короткие вариантные вызовы (SNV и вставки), в противном случае использовались вариантные вызовы GRCh47.Варианты были отфильтрованы, чтобы требовался флаг «PASS» и чтобы минимальная общая глубина чтения (DP/DPI) была равна 10. Вызовы вариантов hg38 и GRCh47 были преобразованы в hg19 с помощью Picard LiftoverVcf (http://broadinstitute.github.io/picard). /). Анализ вариантов бремени в случаях из проекта «100 000 геномов» выполняли, как описано ранее, путем сравнения с контрольной когортой ICGC.

Анализ обогащения пути

Анализ обогащения пути был выполнен с использованием g:Profiler с параметрами по умолчанию (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler) 107 . Набор генов, кодирующих белок, был ранжирован в соответствии с общим количеством патогенных SNV, indels и CNV, наблюдаемых в нашей когорте. Набор регуляторных генов был ранжирован в соответствии с общим количеством приоритетных регуляторных вариантов, наблюдаемых среди случаев, когда гены неуловимы. Скорректированные значения p рассчитывали с использованием поправки Бонферрони, и только пути со скорректированным значением p <0,05 считались значимыми.

Анализы подгрупп

Для сравнения вариантов нагрузки генов или путей CMP, кодирующих белок, между подтипами CMP была построена серия таблиц сопряженности 2×2, в которой каждый подтип тестировался относительно всех остальных для каждого гена или пути.Случай считался положительным, если он содержал хотя бы один патогенный вариант (SNV, indel и/или CNV), в противном случае он считался отрицательным. Точно так же в тестах на связь с клиническим исходом использовались таблицы сопряженности 2 × 2, и случай считался положительным, если он содержал хотя бы один интересующий вариант. Эквивалентно, нагрузочные тесты для множественных вариантов любого типа, помеченных как «положительные» случаи, как те, которые содержат два или более любых вариантов для тестируемого гена или пути. P-значения были рассчитаны с использованием двустороннего точного критерия Фишера.Чтобы уменьшить погрешность в расчетах ОШ и избежать «нулевых ячеек» в таблицах непредвиденных обстоятельств, к каждой наблюдаемой частоте было добавлено 0,5 (поправка Холдейна-Анскомба). Частота ложных открытий (FDR) применялась после удаления тестов, в которых не наблюдалось никаких вариантов ни в каких образцах для каждого набора тестов (генов или путей). Чтобы выявить обогащение саркомерными/цитоскелетными генами среди всех приоритетных регуляторных вариантов, использовали двусторонний биномиальный тест. Каждый вариант считался «успешным», если вариант был связан с саркомерным геном, и считался «неудачным», если вариант был связан с другой категорией генов.Априорная вероятность «успеха» была установлена ​​равной 8/133, т.е. равной доле саркомерных генов среди общего набора известных генов CMP. Все статистические анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения R версии 3.5.1.

Экспрессия генов и белков миокарда

Миокард ЛЖ был получен от пациентов с КМП, которые дали согласие на биобанкирование тканей, оставшихся во время операции на сердце или трансплантации сердца, и был немедленно заморожен в операционной и помещен в жидкий азот.

Секвенирование РНК (RNAseq)

Для измерения экспрессии миокардиального гена RNAseq выполняли с использованием платформы Illumina HiSeq 2500 в TCAG в 35 образцах ЛЖ. Суммарную РНК выделяли из образцов миокарда ЛЖ с помощью набора RNeasy Mini (QIAGEN, Канада). Сгенерированные необработанные данные последовательности были отфильтрованы в соответствии с процедурами, описанными ранее 108 . Прочтения отфильтрованных последовательностей были выровнены с браузером генома человека UCSC hg19 с использованием Tophat v.2.0.11 и обработаны для извлечения исходных значений прочтений для генов с использованием htseq-count v.0.6.1п2. Данные секвенирования были сопоставлены с транскриптомом человека с использованием сплайсированного выравнивателя HISAT2 109 , а уровень экспрессии генов был количественно определен с использованием StringTie 110 . Количество прочтений на килобазу транскриптов на миллион сгенерированных нормировано по размеру каждой библиотеки и по длине транскриптов. Нормализованные данные RNAseq для генов, проанализированных в этом исследовании, доступны в Supplementary Table 10 . Анализ экспрессии проводили для определения кратности различий в экспрессии мРНК у пациента с положительным вариантом по сравнению со средними значениями в оставшейся когорте (т.е. пациенты без кандидата SNV или CNV на WGS) 111 .

qRT-PCR

Для дополнительного подтверждения разницы в уровне экспрессии мРНК гена, несущего вариант, по сравнению с последовательностями дикого типа, мы определили относительную экспрессию мРНК с помощью qRT-PCR 112 . Тотальную РНК экстрагировали из миокарда ЛЖ пациента с использованием набора для очистки РНК mirVana™ PARIS™ и нативного белка (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.Концентрацию и чистоту РНК оценивали с помощью Nanodrop 2000c (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA). РНК с соотношением A260/280, равным 2,0±0,05, дополнительно оценивали на целостность с использованием TapeStation 4200 (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США). Образцы РНК с числом целостности РНК выше 5 и соотношением рРНК 1,7-2,0 использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы SuperScript IV (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Конкретные олигонуклеотидные праймеры для каждого варианта (, дополнительная таблица 11, ) были разработаны Primer3-NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) и синтезированы с помощью технологий Integrated DNA (Коралвилл, Айова, США). Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH, человек) использовали в качестве гена домашнего хозяйства для нормализации. qRT-PCR проводили в системе qPCR ViiA7 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Общий объем ПЦР-реакции составлял 10 мкл, а условия ПЦР состояли из стадии выдержки при 50°С в течение 2 мин, затем при 95°С в течение 2 мин с последующими 40 циклами по 15 с при 95°С и 15 с при 55°С. 60°C (зависит от Primer Tm) и 72°C в течение 1 мин.Относительное количественное определение мРНК проводили с использованием метода 2 -ΔΔ C t 113 . Экспрессию мРНК генов-мишеней в миокарде ЛЖ пациента, несущего вариант, сравнивали с тканями дикого типа, полученными от других людей, включая образец вскрытия человека без сердечного заболевания, а также пациентов с CMP, у которых не было известного патогенного кодирования. или регуляторные варианты. Эксперименты проводили три независимых раза, и каждый эксперимент включал в себя 3 технические повторности.Различия между пациентами с вариантом и без него анализировали с помощью непарного t-критерия Стьюдента и считали значимыми при р<0,05.

Вестерн-блоттинг

Чтобы определить, связано ли изменение экспрессии мРНК с изменением экспрессии белка, для оценки экспрессии миокардиального белка проводили Вестерн-блоттинг 114,115 . Замороженные ткани гомогенизировали в жидком азоте и лизировали в буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA) и смеси ингибиторов протеаз (Sigma, St.Луис, Миссури, США). Образцы смешивали с загрузочным буфером, нагревали при 90°C в течение 5 мин, разделяли с помощью SDS-блота 4-12% Bis-Tris plus (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. После блокирования мембраны 5% обезжиренным сухим молоком в фосфатно-солевом буфере (PBS; pH: 7,4) мембрану инкубировали либо с кроличьим моноклональным антителом FKTN (ab131280; abcam, Кембридж, Великобритания), либо с кроличьим поликлональным TGF. β 3 Антитело (ab15537, abcam, Кембридж, Великобритания), кроличье PRKAG2 Поликлональное антитело (MBS

85, MyBiosource, Сан-Диего, Калифорния, США) или

Поликлональное антитело NRAP (PAS-88772; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) , США) в блокирующем буфере в течение 2 часов (ч) при комнатной температуре (, дополнительная таблица 12, ).Эталонный ген GAPDH (ab8245, abcam, Кембридж, Великобритания) использовали в качестве контроля загрузки. После обширной промывки мембраны PBS/Tween-20 в качестве вторичных антител использовали козий антикроличий IgG-HRP и козий антимышиный IgG-HRP (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в разведении 1:2000 на 1 ч при комнатной температуре. Реактивные полосы визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc MP (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Экспрессию белка в миокарде ЛЖ пациента, несущего этот вариант, сравнивали с контрольными образцами других пациентов с CMP, у которых не было этого варианта.Результаты были количественно оценены с использованием программного обеспечения ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/), и относительное содержание белка в сигнале иммуноблота от каждого целевого белка было нормализовано к среднему содержанию сигнала иммуноблота в контрольных образцах. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента на данных двух независимых экспериментов. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Иммуногистохимия (IHC)

Фиксированная формалином и залитая парафином (FFPE) ткань LV от пациента с CMP с вариантом промотора LARGE1 и контроля без вариантов LARGE1 использовали для анализа IHC с использованием стандартных методик 116 .Блоки ткани FFPE делали срезы толщиной 4 мкм, депарафинизировали в ксилоле, обезвоживали последовательным разбавлением раствора этанола и промывали PBS. Извлечение антигена выполняли в растворе для извлечения мишеней (Dako, Burlington, ON, Канада) в течение 45 минут с последующим блокированием тканей 3% водородной пероксидазой (H 2 O 2 ) в течение 10 минут. После промывания PBS срезы тканей инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с первичным антителом против LARGE1 (PA5-78393, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) с последующей инкубацией срезов с биотинилированным вторичным антителом в течение еще 30 минут. Дополнительная таблица 12) .Иммуномаркирование выявляли с помощью наборов EnVision+ System-HRP DAB (Dako, Burlington, ON, Канада). Срезы исследовали и визуализировали с помощью светового микроскопа. Ядра клеток контрастировали с помощью реагента для гистологического окрашивания гематоксилина Майера (Dako, Burlington, ON, Канада). Фотографии анализировали с помощью программного обеспечения для автоматизированного анализа изображений (Image J, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Количество LARGE1-позитивных клеток усредняли по 10 полям на срез и повторяли в 3 повторах.Окрашивание сравнивали у индивидуума, несущего вариант LARGE1 , и у контрольной группы. Для определения различий между группами использовали непарный t-критерий Стьюдента. Значение p <0,05 считалось значимым.

Репортерные анализы в кардиомиоцитах, полученных из ИПСК человека

Получение кардиомиоцитов ИПСК человека Набор для дифференцировки кардиомиоцитов STEMdiff.Линия иПСК PGP17_11 лишена каких-либо известных вариантов заболеваний сердца, и ранее был описан протокол дифференцировки в кардиомиоциты
114 . Биение дифференцированных кардиомиоцитов, полученных из иПСК, наблюдали на 8-й день после дифференцировки. Клетки повторно высевали на 16-й день в 12-луночные планшеты для транзиторной трансфекции. Кардиомиоциты котрансфицировали конструкциями люциферазы на 21-й день. Трансфицированные клетки собирали через 48 ч после трансфекции и измеряли активность люциферазы светлячка и попугая с использованием системы анализа репортера Dual-Luciferase®.

Репортерный анализ люциферазы

Для функциональной проверки влияния варианта на транскрипцию гена использовали систему Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для тестирования и сравнения транскрипционной активности репортерного гена люциферазы под действием вариантной последовательности промотора или энхансера+промотора от пациента, или эталонной последовательности генома каждой регуляторной области в качестве контроля дикого типа 67,68 . Чтобы создать плазмиды люциферазы, содержащие последовательность регуляторного элемента предсказанных вариантов и дикого типа в качестве контроля, нуклеотидные последовательности 1.5 т.п.н. промоторной области BRAF, DSP, DTNA, FKRP, FKTN и LARGE1 и 2 т.п.н. энхансерной/промоторной области TGFB3 , содержащие самую сильную область активации транскрипции, были коммерчески синтезированы ( Дополнительная таблица 13 ) (Synbio Technologies, Monmouth Junction, NJ, USA). Коммерческие плазмиды, кодирующие соответствующие последовательности дикого типа, энхансера или промоторного варианта, расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали по отдельности во множество сайтов клонирования основных векторов люциферазы Firefly (pGL4.10-luc2; Промега, Мэдисон, Висконсин, США). Кардиомиоциты, полученные из иПСК человека, высевали в 12-луночные планшеты и совместно трансфицировали 2 мкг векторов люциферазы светлячка (pGL4.10-luc2; Promega, Мэдисон, Висконсин, США), содержащих регуляторные последовательности дикого типа, BRAF, DSP, Варианты DTNA, FKRP, FKTN и LARGE1 или TGFB3 и 40 нг контрольных репортерных векторов люциферазы Renilla (вектор pRL-TK; Promega, Мэдисон, Висконсин, США) для нормализации условий трансфекции.Через 48 ч после трансфекции люминесценцию обнаруживали с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter (DLR™). Эксперимент проводили в трех независимых повторностях, и каждый образец также тестировали в трех повторах в каждом эксперименте. В той же лунке измеряли люциферазу светлячка, а затем люциферазу Renilla. Нормализующую активность экспериментального репортера рассчитывали путем деления сигнала люциферазы светлячка на сигнал внутренней люциферазы renilla. Управляемый промотором контрольный вектор люциферазы светлячка (pGL4.13-luc2/SV40; Promega, Мэдисон, Висконсин, США) использовали в качестве эталона. Непарный двусторонний t-критерий Стьюдента использовали для сравнения разницы между люциферазной активностью репортерного гена люциферазы под действием последовательности регуляторного варианта и эталонной последовательностью каждой регуляторной области в качестве контроля дикого типа. Порог значимости был установлен на уровне p<0,05.

Массивно-параллельный репортерный анализ (MPRA)

Олигонуклеотиды длиной 135 п.н. со штрих-кодом 11 п.н. были разработаны и синтезированы компанией TwistBioscience (США).Варианты располагались в центре олигонуклеотида длиной 135 п.н. Полный список протестированных вариантов можно найти в дополнительной таблице 6 . Для контроля технических вариаций и оценки биологической релевантности каждый протестированный аллель был представлен как минимум 25 раз, каждый с уникальным штрих-кодом. Библиотека олигонуклеотидов содержала 2700 олигонуклеотидов для наших геномных вариантов, 100 олигонуклеотидов для положительных контролей и 1500 олигонуклеотидов для отрицательных контролей, то есть зашифрованных последовательностей. Эти олигонуклеотиды были частью библиотеки олигонуклеотидов, которая включала дополнительные 234 500 последовательностей в рамках более крупного исследования.Стратегию клонирования библиотеки олигонуклеотидов и отбор положительных отрицательных контролей (300 случайных последовательностей, каждая с 5 штрих-кодами) выполняли согласно Mattioli et. ал 23 . Библиотеку олигонуклеотидов трансфицировали в пять биологических повторов кардиомиоцитов, полученных из иПСК PGP17, с эффективностью трансфекции более 80% во всех повторах с использованием реагента для трансфекции стволовых липофектаминов (STEM00015 Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) (, дополнительная фигура 3b ).Через 48 часов после трансфекции собирали общую РНК и удаляли загрязнение ДНК с помощью ДНКазы I (18047019, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA). Образцы РНК с числом целостности РНК >7 использовали для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы SuperScript IV (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). кДНК использовали для синтеза библиотеки, если в ней отсутствовало загрязнение плазмидами, что определяли с помощью qRT-PCR, выполненной на системе qPCR ViiA7 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, США). Калифорния, США) (, дополнительный рисунок 3c ).Библиотеки Tag-seq были подготовлены, как описано ранее 23 , и секвенированы с односторонним считыванием 50 п.н. на платформе HiSeq2500 (TCAG, Госпиталь для больных детей, Торонто). Данные анализировали с использованием программного обеспечения MPRAAnalyze 23 117 с использованием случайных последовательностей олигонуклеотидов в качестве нулевого распределения. Значения P были рассчитаны с использованием теста отношения правдоподобия с MPRAAnalyze, и FDR<0,05 считался значимым.

Редактирование CRISPR-Cas9 для оценки функции нового гена у эмбрионов рыбок данио

Все исследования эмбрионов рыбок данио проводились в Центре генетики и моделей заболеваний SickKids (Zebrafish Core), Торонто, и были одобрены Комитетом по уходу за животными SickKids (протокол № 401951). .

Дизайн направляющей РНК (гРНК), синтез и микроинъекция

Все последовательности гРНК были адаптированы из 45 и описаны в дополнительной таблице 14 . Последовательности праймеров (, дополнительная таблица 15 ) были синтезированы с помощью интегрированных технологий ДНК (IDT, Коралвилл, Айова, США) и использованы для синтеза sgRNA in vitro в соответствии с ранее описанным протоколом 45 . Микроинъекции выполняли, как описано ранее 45 с небольшими изменениями.Вкратце, для nrap гРНК1 250 пг каждой гРНК с 800 пг белка Cas9 (Alt-R ® Sp Cas9 Nuclease V3, № по каталогу 1081058, IDT, Коралвилл, Айова, США) совместно вводили в клетки дикого типа эмбрионы на стадии одной клетки. Для совместной инъекции 8 гРНК fhod3a+b , гРНК1-гРНК4 вводили 125 мкг каждой гРНК, в то время как количество белка Cas9 оставалось неизменным. Инъецированные эмбрионы содержали в 0,003% растворе фенилтиомочевины (PTU) и инкубировали в темном инкубаторе при 28,5 °C в течение 3 дней.Весь фенотипический анализ, визуализация, экстракция ДНК и секвенирование проводились через 3 дня после оплодотворения (dpf).

Экстракция ДНК, ПЦР и анализ последовательности

Неочищенную ДНК экстрагировали из целых личинок рыбок данио с использованием буфера 1X-PCR (10 мМ KCl, 10 мМ Трис, PH 8,0; 1,5 мМ MgCl2), содержащего 1 мг/мл протеиназы K (Thermo Scientific , Уолтем, Массачусетс, США). Смесь инкубировали при 55 °C в течение 50 минут, а затем при 98 °C в течение 10 минут для деактивации протеиназы K. Для секвенирования каждой области гРНК проводили ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Taq (Bio basic, Markham, ON, Канада).25 мкл реакционной смеси содержали реакционный буфер 1X-PCR, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, по 0,2 мМ каждого прямого и обратного праймеров, 0,75 ед. полимеразы Taq и 1,5 мкл неочищенной ДНК (~200 нг). Пары праймеров и соответствующие им температуры отжига приведены в дополнительной таблице 15 . Реакции ПЦР устанавливали следующим образом: 95°C в течение 5 мин, затем 35 циклов 95°C в течение 20 с, температура отжига в течение 1 мин, 72°C в течение 1 мин и конечное удлинение 72°C в течение 5 мин. . Продукт ПЦР очищали с использованием ExoSAP-IT (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя, и 100 нг каждого продукта ПЦР отправляли для секвенирования в TCAG (Торонто, Онтарио, Канада) с праймерами для секвенирования, описанными в . Дополнительная таблица 15 .Результаты секвенирования анализировали с помощью ICE Analysis (https://ice.synthego.com/#/) или Geneious 9.1.4.

qRT-PCR

На 3 dpf собирали объединенные образцы РНК либо из личинок рыбок данио, которым инъецировали гРНК генов-мишеней, либо только Cas9 в качестве контроля с использованием реагента TRIzol™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). кДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя.Праймеры, перечисленные в дополнительной таблице 16 , использовались для амплификации двух эталонных генов β – актина и GAPDH для нормализации данных. Анализ qRT-PCR проводили на машине Roche LightCycler 96 с использованием PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Относительный уровень экспрессии рассчитывали на основе двух технических повторов с использованием метода 2 -ΔΔCT 113 .

Секвенирование

Образцы ДНК были извлечены из целых личинок рыбок данио на 3 dpf и отправлены для секвенирования по Сэнгеру в TCAG (Торонто, Онтарио, Канада) для подтверждения эффективности разрезания экзонов, на которые нацелены nrap, fhod3a и fhod3b гРНК по сравнению с Cas9 только в качестве контроля.Инструмент анализа ICE CRISPR (Synthego, Menlo Park, CA) использовался для анализа изменений CRISPR в fhod3b .

Фенотипирование сердца рыбок данио

Фенотипирование сердца эмбрионов рыбок данио проводили на 3 днях в день для оценки морфологии, размера и функции камер сердца. Для микроскопии дикого поля in vivo изображения личинок данио 3 dpf анестезировали 0,02% трикаином и помещали в 3% метилцеллюлозу в чашки со стеклянным дном диаметром 50 мм. Видеоизображение было сделано с помощью микроскопа Zeiss AXIO Zoom V16 с использованием PlanNeoFluar Z 1X/0.25 FWD 56 мм объектив с 112-кратным увеличением. Использовалась функция Movie Recorder в программе Zen pro, и для каждого видео записывалось около 100 кадров. Все видео экспортировались со скоростью 17 кадров в секунду для дальнейшего анализа. Изображения были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse Ti с системой конфокальной визуализации Nikon A1 plus с использованием программы NIS-Elements. Площадь предсердий измерялась в конечной систоле, а площадь желудочков измерялась в конечной систоле и конечной диастоле с фракцией выброса желудочков, определяемой как (конечная диастолическая площадь — желудочковая систолическая площадь) / конечно-систолическая площадь желудочков x 100 с использованием ImageJ (). https://изображение.nih.gov/ij/). Размеры предсердий и желудочков и фракцию выброса желудочков сравнивали с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента для измерения значительных различий между мутантами ( nrap и fhod3 ) и контролями (Cas9 и дикий тип). Различия считали статистически значимыми при Р<0,05.

Доступность данных

Данные секвенирования в настоящее время хранятся в Европейском архиве генома и фенома EGA и будут доступны для скачивания после утверждения Комитетом по доступу к данным.Дополнительные данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в файлы дополнительной информации, а дополнительные необработанные данные, используемые для рисунков и результатов, можно получить у соответствующего автора по разумному запросу. Все вычислительные инструменты, используемые в этом исследовании, доступны как коммерческое программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом.

Доступность данных

Данные секвенирования в настоящее время хранятся в Европейском архиве генома и фенома EGA и будут доступны для скачивания после утверждения Комитетом по доступу к данным.Дополнительные данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в файлы дополнительной информации, а дополнительные необработанные данные, используемые для рисунков и результатов, можно получить у соответствующего автора по разумному запросу. Все вычислительные инструменты, используемые в этом исследовании, доступны как коммерческое программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа финансировалась Центром исследований сердца Теда Роджерса (SM and JE). SM возглавляет Канадский фонд сердца и инсульта / кафедру Роберта М. Свободы в области сердечно-сосудистых наук.SWS занимает кафедру GlaxoSmithKline Endowed в области наук о геноме в Больнице для больных детей и Университете Торонто. PGM занимает 2-е место в Канаде по изучению механизмов некодирующих заболеваний. PGM признает поддержку Фонда новых границ в исследованиях правительства Канады (NFRF), [NFRFE-2018-01305]. Е.О. имеет семейную профессуру Битове в области врожденных пороков сердца у взрослых. ММ имеет грант Рамона и Кахала от Министерства науки и инноваций Испании (RYC-2017-22249). WO поддерживается фондом Fundació La Marató (321/C/2019).JB финансируется стипендией Франса Ван де Верфа для клинических сердечно-сосудистых исследований и стипендией старшего клинического исследователя FWO Flanders. КМ был научным сотрудником Национального научного фонда по гранту №. DGE1144152 на протяжении большей части проекта. Проект 100 000 геномов управляется Genomics England Limited (компания, находящаяся в полной собственности Министерства здравоохранения и социального обеспечения). Проект 100 000 геномов финансируется Национальным институтом исследований в области здравоохранения и Национальной службой здравоохранения Англии.Wellcome Trust, Cancer Research UK и Совет по медицинским исследованиям также финансировали исследовательскую инфраструктуру.

CONSORTIA

Genomics England Research Consortium

Ambrose, J.C. 1 ; Арумугам, стр. 1 ; Baple, EL 1 ; Бледа, М. 1 ; Бордман-Претти, Ф. 1,2 ; Boissiere, JM 1 ; Bustred, C.R. 1 ; Бриттен, Х. 1 ; Колфилд, М. Дж. 1,2 ; Чан, GC 1 ; Крейг, К.EH 1 ; Догерти, Л. К. 1 ; де Бурка, А. 1 ; Деверо, А. 1 ; Элгар, Г. 1,2 ; Foulger, RE 1 ; Фаулер, Т 1 .; Фурио-Тари, П. 1 ; Гисс А. 1 ; Hackett, JM 1 ; Халаи, д. 1 ; Хэмблин, А. 1 ; Хендерсон, С. 1,2 ; Холман, Дж. Э. 1 ; Хаббард, Т. Дж. П. 1 ; Ибаньес, К. 1,2 ; Джексон, Р. 1 ; Джонс, Л.J. 1,2 ; Касперавичюте, д. 1,2 ; Кайикчи, М. 1 ; Кусатанас, А. 1 ; Ланштайн, Л. 1 ; Лоусон, К. 1 ; Leigh, SE 1 ; Леонг, США 1 ; Лопес, Ф. Дж. 1 ; Маледи-Кроу, Ф. 1 ; Мейсон, Дж. 1 ; McDonagh, E.M. 1,2 ; Муцианас, Л. 1,2 ; Мюллер, М. 1,2 ; Муругаесу, Н. 1 ; Need, A.C. 1,2 ; Odhams, CA 1 ; Ориоли А. 1 ; Патч, С. 1,2 ; Перес-Хил, д. 1 ; Перейра, М.Б. 1 ; Полихронопулос, Д. 1 ; Пуллинджер, Дж. 1 ; Рахим, Т. 1 ; Рендон, А. 1 ; Риесго-Феррейро, стр. 1 ; Роджерс, т. 1 ; Райтен, М. 1 ; Сэвидж, К. 1 ; Савант, К. 1 ; Скотт, Р. Х. 1 ; Сиддик, А. 1 ; Зигхарт, А. 1 ; Смедли, Д. 1,2 ; Smith, K.R. 1,2 ; Смит, С.С. 1 ; Сосинский А. 1,2 ; Спунер, W. 1 ; Stevens, HE 1 ; Стаки, А. 1 ; Султана, Р. 1 ; Танги М. 1 ; Thomas, ERA 1,2 ; Томпсон, С. Р. 1 ; Трегидго, С. 1 ; Туччи, А. 1,2 ; Уолш, Э. 1 ; Waters, SA 1 ; Welland, M. J. 1 ; Уильямс, Э. 1 ; Витковская, К. 1,2 ; Древесина, С. М. 1,2 ; Заровецкий, М. 1

1. Genomics England, Лондон, Великобритания

2. Научно-исследовательский институт Уильяма Харви, Лондонский университет королевы Марии, Лондон, EC1M 6BQ, Великобритания.

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

RL, AS, JE, SM разработали концепцию и разработали работу; RL, AS, OA, JB, TL, RY, FM, RRN, AM, QY, GM, MCSY, WWL, BT, GERC, JL, EO, LB, JS, TM, JE, SWS, SM, полученные, проанализированные или интерпретированные данные; RL, OA, TL, RY, MCSY, WWL, BT выполнили биоинформатический анализ; KM, KD, WO, MM, PGM разработали, выполнили и проанализировали набор данных MPRA; Р.Л., А.С., С.М. составили оригинальную рукопись; RL, AS, PGM, JE, SWS, SM существенно переработали его; и все авторы рассмотрели и одобрили окончательный вариант рукописи.

КОНКУРЕНТ ИНТЕРЕСОВ

SWS является научным консультантом Population Bio, Научного консультативного совета Deep Genomics, и его исследовательские патенты, принадлежащие Больнице для больных детей, лицензированы Lineagen и Athena Diagnostics. Другие авторы не имеют конфликтов интересов, которые следует раскрывать.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ НА РИСУНКАХ

Дополнительный рисунок 1: Результаты секвенирования редактирования генов у рыбок данио . Секвенирование по Сэнгеру рыбок данио с отредактированным геном (n = 7) выявило высокую нагрузку мутаций в экзонах, на которые нацелены 4 gRNAs для (a) nrap и (b) fhod3ab по сравнению с контролем только Cas9.Панели показывают эталонную последовательность, расположение гРНК, экзон-мишень, эффект только Cas9 по сравнению с гРНК CRISPR/Cas9 у эмбрионов рыбок данио. SNV, вставки и большие делеции видны коричневым и синим цветом. nrap, fhod3a и fhod3b гРНК вызывали редактирование CRISPR у всех инъецированных эмбрионов и при необходимости анализировались с использованием программного обеспечения Synthego ICE.

Ref-seq, эталонная последовательность: гРНК, направляющая РНК; ICE, вывод о редактировании CRISPR

Дополнительный рисунок 2: Пути, обогащенные кодирующими белок и регуляторными вариантами в общей когорте (n = 228) .( a ) Генная онтология (категория молекулярной функции) и пути Reactome, обогащенные вариантами кодирования и сплайсинга патогенных белков. ( b ) Пути, обогащенные регуляторными вариантами уровня 1 высокого риска, включая категории, связанные с мышцами, связывание дистрогликана, рецепторы фактора роста фибробластов и пути Ras.

Дополнительная фигура 3: Прогностическое влияние регуляторных вариантов на мотив связывания фактора транскрипции . SeqLogo использовали для предсказания нарушения мотива, вызванного вариантами регуляторных элементов ( a, b ) BRAF , ( c ) DSP , ( d ) DTNA 70 84 e FKRP , ( F, G ) FKTN , ( ч, I ) Bard1 , ( J ) PRKAG2 и ( K ) TGFB3 .Пара нуклеотидных оснований, обведенная красным прямоугольником, указывает положение варианта в мотиве. Анализ регуляторной последовательности вариантов показывает изменение одного нуклеотида в каждом варианте по сравнению с эталонной последовательностью, приводящее к нарушению мотивов фактора транскрипции, которое, как предполагается, связано с повышающей или понижающей регуляцией транскрипции гена-мишени.

Major, эталонная последовательность; Риск, вариантная последовательность.

Дополнительная фигура 4: Анализы люциферазы в CM, полученных из hiPSC .( a ) Использовали векторы репортерного гена люциферазы, содержащие различные промоторные последовательности. Управляемый промотором контрольный вектор люциферазы светлячка (pGL4-13_luc2_SV40) и основной вектор люциферазы светлячка без промотора (pGL4-10-luc2) использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Для нормализации условий трансфекции использовали контрольные репортерные векторы люциферазы Renilla (вектор pRL_TK). Последовательности регуляторных элементов предсказанных вариантов и дикого типа были коммерчески синтезированы и клонированы отдельно во множественные сайты клонирования основных векторов люциферазы светлячка, pGL4.10_luc2. CM, полученные из hiPSC, совместно трансфицировали вектором люциферазы светлячка, содержащим регуляторные последовательности отдельно, и контрольным репортерным вектором люциферазы Renilla. Люминесценцию обнаруживали с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter (DLR™). ( b ) Успешная дифференцировка (окрашивание сердечного тропонина Т красным цветом) и трансфекция плазмиды pX601_GFP (зеленый цвет) в кардиомиоциты, полученные из иПСК PGP17 на 21-й день, с использованием реагента для трансфекции стволовых клеток липофектамина. Увеличение: ×20. ( c ) qRT-PCR проводили для обнаружения загрязнения ДНК в результате трансфекции плазмидного пула 5 биологических повторов кардиомиоцитов PGP17.( d ) Унимодальное распределение штрих-кодов, представляющих олигонуклеотиды, используемые в этом проекте. Вводимая ДНК представляет собой плазмидный пул олигонуклеотидов, в то время как реплики 1-5 (каждая реплика разделена на две дорожки HiSeq2500) проточной клетки представляют собой библиотеки tag-seq, полученные в результате трансфекции кардиомиоцитов. ( e ) Корреляция Пирсона 5 повторов MPRA. hiPSC, индуцированная человеком плюрипотентная стволовая клетка; СМ, кардиомиоциты; GFP, зеленый флуоресцентный белок; Р, плазмида; пр, промоутер; En, усилитель; Люк, Люцифераза; RES, последовательность регуляторного элемента, WT, дикий тип; В, Вариант; rep, replicate

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТАБЛИЦЫ

Дополнительная таблица 1: Клинические характеристики пробандов детской кардиомиопатии в когорте открытия (n=228).

Дополнительная таблица 2: Список генов кардиомиопатии.

Дополнительная таблица 3: Гены кардиомиопатии, несущие патогенные или вероятно патогенные кодирующие SNV и инделы (n = 228 несвязанных случаев).

Дополнительная таблица 4: Варианты количества копий, влияющие на гены кардиомиопатии (n = 228 несвязанных случаев).

Дополнительная таблица 5: Варианты потери функции в новых генах кардиомиопатии (n = 228 несвязанных случаев).

Дополнительная таблица 6 : Варианты потери функции в NRAP и FHOD3 в когортах обнаружения кардиомиопатии (n = 228) и репликации (n = 1266).

Дополнительная таблица 7: SNV уровня 1 высокого риска (и кандидаты) в регуляторных элементах генов кардиомиопатии (n = 228 случаев)

Дополнительная таблица 8 (n = 228 случаев)

Дополнительная таблица 9: Регуляторные области генов кардиомиопатии для картирования некодирующих вариантов.

Дополнительная таблица 10: Нормализованные данные РНКсек для генов с CNV высокого риска, LoF и регуляторных вариантов

Дополнительная таблица 12: Антитела, используемые для вестерн-блоттинга и иммуногистохимии.

Дополнительная таблица 14: Дизайн одиночных направляющих РНК для нацеливания на новые гены у эмбрионов рыбок данио.

Дополнительная таблица 15: Пары праймеров для редактирования CRISPR-Cas9 новых генов у эмбрионов рыбок данио.

Дополнительная таблица 16: Пары праймеров для qRT-PCR для новых генов, на которые направлено редактирование генов CRISPR-Cas9 у эмбрионов рыбок данио.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы выражаем благодарность Семейному кардиологическому центру Labatt Biobank при больнице для больных детей за доступ к образцам ДНК для секвенирования всего генома и Центру прикладной геномики при больнице для больных детей за проведение секвенирования. Мы благодарим Xiucheng Cui и Emanuela Pannia за проведение экспериментов с рыбками данио в центре генетики и моделей заболеваний рыбок данио SickKids (синтезы CRISPR-Cas9 и гРНК, микроинъекции эмбрионов рыбок данио, проверка ПЦР гРНК, qRT-PCR, визуализация сердца).Это исследование стало возможным благодаря доступу к данным и выводам, полученным в рамках проекта «100 000 геномов». Проект «100 000 геномов» использует данные, предоставленные пациентами и собранные Национальной службой здравоохранения в рамках их ухода и поддержки. Мы благодарим членов рабочих групп ICGC/PCAWG за создание вариантов вызовов, используемых в наших анализах бремени случай-контроль.

Книжные издатели, которых следует избегать (и другие мошеннические схемы авторов)

Стать издаваемым автором — мечта почти каждого писателя.К сожалению, существует множество ненадежных компаний, которые хотят быстро заработать, используя эти мечты. Чтобы помочь вам защитить свою работу, свой банковский счет и свое достоинство, вот типы теневых компаний и книгоиздателей, которых вам следует избегать:

1. Издательства Vanity Press, выдающие себя за традиционных издателей 

Кому не понравится, если издатель предложит переиздать одно из ваших самостоятельно опубликованных произведений или опубликовать вашу следующую книгу, верно? Возможно, вы даже будете рады заплатить некоторые сборы, чтобы запустить производственный процесс.

Но это было бы большой ошибкой. Ни один законный традиционный издатель не попросит вас оплатить счет. На самом деле, приобретая вашу книгу, они заплатят вам аванс. Итак, в девяти из десяти случаев, если издатель просит вас заплатить за публикацию, это тщеславная пресса.

Некоторые массовые прессы тщеславия, которых вы можете избегать, включают: 

  • Публикация страниц
  • Экслибрис
  • Авторские решения

Некоторые мошенники даже маскируются под отпечатки Большой пятерки.Известным кластером мошенников является филиппинская сеть, ранее связанная с Authors Solution, а теперь работающая отдельно. В первые месяцы пандемии Covid-19 они начали нацеливаться на отчаявшихся авторов с помощью «издательского пакета», который стоил точно такую ​​же сумму, какую получали американские граждане в рамках своего федерального чека на стимулирование.

В наши дни недостаточно просто узнать имена ненадежных издателей. Кажется, каждый месяц открываются новые печатные станки для тщеславия — и, поскольку их имена не связаны с «плохой прессой», они могут убедить многих авторов платить за их услуги.Чтобы понять, почему публикация в прессе для тщеславия — ужасная идея, перейдите к следующему посту в этом руководстве, в котором обсуждается опасность «платы за публикацию».

Если вы хотите работать с надежными издателями, просмотрите наш каталог независимых изданий, все из которых прошли тщательную проверку.

2. Многообещающие книжные сделки «литературных агентов»

Еще один вид мошенничества, с которым вы можете столкнуться, — это мошенничество с агентами. Если литературный агент без просьбы свяжется с вами, чтобы предложить сделку с издателем, или попросит вас заплатить за чтение, ваше паучье чутье должно сильно покалывать.

Во-первых, литературные агенты никогда не свяжутся с вами напрямую — если только вы уже не станете чрезвычайно успешным автором (и даже в этом случае большинство авторитетных агентов не станут переманивать вас из вашего нынешнего представительства). Если вы принадлежите к 99% авторов, которые еще не достигли большого успеха, единственный способ заставить агента представлять вас и вашу книгу — отправить им письмо с запросом.

Во-вторых, ваш агент никогда не должен просить вас платить за что-либо. Даже если они помогут вам отшлифовать вашу рукопись перед отправкой в ​​издательство, это не должно взиматься плата.Агенты работают за комиссию, то есть вы платите им только тогда, когда они успешно помогли продать вашу книгу издателю.

Когда дело доходит до агентов, лучше всего придерживаться проверенных списков, таких как список Ассоциации представителей авторов или наш справочник почти 700 литературных агентов по всему миру. Не приближайтесь ни к кому без подтвержденного послужного списка!

Вы подозреваете определенную компанию? Пройдите этот небольшой тест, который поможет вам распознать хищнический бизнес.

Вы имеете дело с издательским мошенничеством?

Пройдите этот быстрый тест, чтобы узнать, имеете ли вы дело с законным издательством.

Начать викторину

3. Чрезмерно завышенные цены на услуги самостоятельной публикации

Хотя самостоятельная публикация по определению означает, что вы делаете это самостоятельно, есть компании, которые могут вам помочь. На самом деле, желательно получить услуги по редактированию и дизайну от надежных профессионалов, чтобы убедиться, что ваша книга имеет высокое качество.

Однако, если вы не будете бдительны, легко попасться на удочку хищников, которые просто хотят завысить цену за свои услуги — многие из этих задач вы могли бы выполнить самостоятельно. Вот некоторые из таких «услуг», которых следует избегать.

Накрутка цен на некачественный монтаж и дизайн

Редакторы и дизайнеры необходимы для успеха книги, и некоторые компании и частные лица используют этот факт, чтобы выкачивать деньги из вашего кармана. Хуже всего то, что они могут даже указать разумную стоимость услуг самостоятельной публикации, оставив вас поначалу ничего не подозревающими, а затем в конечном итоге предоставив некачественную работу.

Когда дело доходит до дизайнеров обложек и иллюстраторов, может быть проще сказать, кто на самом деле профессионал, поскольку их работы хорошо видны. Однако с редакторами и буккоучами, чья работа невидима для читателя (если они выполнили свою работу правильно), вам придется провести некоторое исследование, прежде чем подписывать с ними контракт. Или… вы можете искать профессионалов на Reedsy.

В Reedsy мы проверяем каждого профессионала, проверяя его профессиональный опыт, гарантируя, что каждый фрилансер на нашей платформе либо имеет богатый традиционный издательский опыт, либо является опытным и хорошо зарекомендовавшим себя соавтором независимых книг.Чтобы узнать больше о том, как Reedsy выбирает своих профессионалов, ознакомьтесь с нашими критериями отбора здесь.

Познакомьтесь с квалифицированными профессионалами издательского дела на Reedsy

Более 3000 проверенных редакторов, дизайнеров и маркетологов доступны для найма.

Узнайте, как Reedsy может помочь вам создать красивую книгу.

Получение вашей книги ISBN

Аббревиатура может показаться более сложной, чем она есть на самом деле, но получение Международного стандартного книжного номера (ISBN) — это не то же самое, что присоединиться к иллюминатам: вам не нужно специально представляться или быть чьим-то важным внуком.За 125 долларов любой автор может купить ISBN через Bowker в США или Nielsen в Великобритании: агентства, выпускающие ISBN и не получающие прибыли от их продажи.

Тем не менее, есть много компаний, которые поднимут громкую песню о том, чтобы обеспечить вам ISBN, взимая с вас сотни долларов сверх фактической стоимости — когда вы можете просто потратить 10 минут на Bowker и сделать это самостоятельно.

Если честно, большинство интернет-магазинов для независимых авторов в наши дни предоставляют свои собственные идентификационные коды.Если вы не планируете распространять в обычных магазинах, вам, вероятно, не обойтись без ISBN. Но если он вам просто необходим, ознакомьтесь с нашим руководством о том, как получить его, не заплатив больше, чем вам нужно.

Регистрация авторских прав

Знаете ли вы, что если вы не зарегистрируете авторские права на свою книгу, буквально любой может объявить ее своей работой и получить от этого прибыль?

Итак, это полная ложь , но вы удивитесь, как много людей в это верят.Авторы владеют авторскими правами на свои произведения до и после их публикации. В США регистрация этого авторского права просто предоставляет несколько законных прав, когда дело доходит до требования о возмещении ущерба, и вам потребуется всего 45 долларов, чтобы подать заявку на него онлайн (по состоянию на февраль 2022 года). Для получения более подробной информации о том, как зарегистрировать свои авторские права, вы можете ознакомиться с этим подробным руководством.

4. Маркетинговые пакеты, которые

звучат существенно

Продажа книги — это то, с чем сталкиваются большинство авторов.(Чтобы познакомиться с этой темой, ознакомьтесь с этим руководством.) Поэтому неудивительно, что есть люди, которые предложат решить ваши маркетинговые проблемы за небольшую плату. Давайте покопаемся в чудесных «маркетинговых решениях», которые авторы часто продают:

Пресс-релизы. Всякий раз, когда у компании появляется новая важная «история», она выпускает пресс-релиз и публикует его на сайтах, где его могут найти средства массовой информации. Мошеннические компании будут убеждать вас в том, что New York Times, Good Morning America и Newsweek могут подхватить вашу историю, но шансы на то, что это действительно произойдет, очень малы.

Книжные ярмарки. Каждый год издательский мир стекается на несколько книжных ярмарок, где раскупаются права на публикацию новых изданий. Крупнейшие находятся в Лондоне и Франкфурте (и в Болонье для детских книг), и почти каждый может забронировать столик на этих мероприятиях. Компании-хищники предложат выставить вашу книгу на одной из таких ярмарок за определенную плату. Чаще всего вашей будет одна из бесчисленных книг на столе в каком-нибудь невидимом углу конференц-зала.

Адаптация/освещение сценария. Некоторые издательства предложат составить пакет «покрытия», чтобы упростить продажу вашей книги голливудским продюсерским компаниям. Другие даже нанимают анонимного сценариста, чтобы он адаптировал его для пилотного проекта Netflix. Доказательств успешных питчей никогда не было, но эти услуги наверняка обойдутся вам в копеечку.

Если вам нужен кто-то, кто поможет вам продвигать вашу книгу, убедитесь, что он предлагает услуги, которые напрямую влияют на вашу способность охватить вашего целевого читателя (такие вещи, как цифровая реклама и расширение списка рассылки).Избегайте компаний, которые предлагают грандиозные (но расплывчатые) обещания мгновенной славы.

5. Писательские конкурсы и награды, о которых никто не слышал

Конкурсы писателей — отличный способ привлечь аудиторию, укрепить свои писательские способности и даже заработать немного денег в виде призов. Однако есть конкурсы, которые представляют собой немногим больше, чем прибыльные предприятия. И обычно их можно узнать по тому факту, что их призы на самом деле не призы.

Вы можете купить их оптом в Costco.

В некоторых конкурсах победители публикуются в журнале или антологии — и это здорово. Но иногда «победившие» авторы будут обязаны платить «плату за редактирование» за эту привилегию, что невелико.

Есть также некоторые соревнования, призом в которых может быть трофей. Загвоздка здесь в том, что автор должен будет оплатить стоимость физического приза. Это не обязательно плохо — если только вы не возражаете заплатить 80 долларов за акриловую плиту, десятки других также «выиграли» в этом месяце.

Короче, читайте мелкий шрифт. Чтобы найти проверенные конкурсы, вы можете просмотреть этот каталог лучших писательских конкурсов.

И это относится к большинству издательских компаний, от которых вы хотите держаться подальше в своей карьере автора.


В следующем посте мы более подробно рассмотрим прессы для туалетных столиков, поскольку их довольно сложно обнаружить.

Через карты Таро Dragon Age: Inquisition Я нашел искусство

Я обожаю карты Таро в Dragon Age: Inquisition.Кто бы ни придумал эту идею, я могу поцеловать тебя. Я мог бы с удовольствием смотреть на карты весь день — и я, извините, коллеги. Я купил их, чтобы вставить в рамку и повесить на стену, и я никогда раньше не делал ничего подобного. Странно — Dragon Age не славится своим искусством. Origins была уродливой, а Dragon Age 2 была повсюду, зажатой между старым и новым. У них было искусство, но оно не имело значения. Но с Инквизицией все изменилось.

У Инквизиции были карты Таро. Они жили в меню, представляя все грани игры.Это были персонажи, которых вы встречали, которые менялись вместе с вашими отношениями, и они были выбранным вами классом, монстрами, которых вы убивали, достижениями, которые вы зарабатывали. И они были там в тот момент, когда вы начали свою игру, прямо перед вашим лицом, ослепляя своей восхитительностью.

Итак, технически это не все карты Таро. Некоторые просто великолепные картинки в форме карт. Но настоящих карт Таро достаточно, чтобы заполнить колоду из 78 карт, которую EA напечатала для коллекционного издания игры за 140/160 фунтов стерлингов. Жаль, что я не купил ее — вы не можете найти ее меньше чем за сотни фунтов на eBay в эти дни, колода.Конечно, вы можете купить их как игральные карты (и я купил), но это не имеет смысла.

Потому что я люблю их за то, что они карты Таро. Для меня Таро означает нетрадиционное и странное, что совсем не похоже на BioWare, обычно такое мягкое и клиническое. И Таро покрыты символикой, которую я не понимаю, как будто там скрывается целая другая история, ожидающая своего открытия. Это завораживает меня!

Это действительно зовет меня, потому что я уже видел подобное раньше, еще на уроках истории.Мы изучали картины эпохи Возрождения и религиозные картины, и учитель рассказывал нам — и я почти слушал — о том, что все в раме имеет значение. Жесты рук, предметы, цвета, даже фрукты. И там я просто подумал, что дети выглядят странно. Но это застряло во мне. И все это снова вспыхнуло, когда появилась Инквизиция.

Посмотрите на эти картинки — круто, не так ли? И это не половина дела, поверь мне. Вы не можете смотреть на них и не видеть скрытого смысла.Посмотрите, какие преднамеренные жесты рук и что они держат. Пальцы, указывающие вверх, символы бесконечности, открытые ладони с пламенем внутри, странные круги и звезды и излучающий свет.

Но что действительно бросается в глаза, так это оранжевый цвет за головой парня слева (Блэкволл) или синий свет вокруг парня посередине (Солас). Они очень напоминают мне старые религиозные картины, на которых у Иисуса и его друзей к затылку прикреплены диски, мало чем отличающиеся от тех конусов, которые ветеринары прикрепляют к собакам, чтобы они не грызли раны.Но что они означают? И вот тут начинается мое путешествие по кроличьей норе.

Добро пожаловать в мир иконографии! Сбивающий с толку язык, придуманный сотни лет назад, потому что люди не умели читать — гораздо проще было передать сообщение через картины. А сила картин была огромна. Таких вещей люди еще не видели. У них не было галерей дальше по дороге, в которые они могли бы заглянуть. Их жизнь была тяжелой, земной и коричневой. Но у них действительно были церкви, и когда в тех церквях были золотые картины, это было большое дело.Это было похоже — и должно было быть похоже — смотреть на что-то с Небес.

Круги за головами — это ореолы — или нимбы, или ореолы, чтобы дать им более причудливые названия. Предполагается, что они изображают нетварный свет небес, излучаемый наружу, для чего и предназначалась специальная краска из сусального золота. А они круглые, потому что это «самая гармоничная и совершенная форма», согласно найденной мной статье «Как читать и понимать русскую икону» — я удивлен, что вы ее не читали, честно говоря.

Но нимбы восходят гораздо дальше христианства: они восходят к Древнему Египту. Вы можете увидеть их на головах бога с птичьим ликом Ра, или Исиды. Они подобны мини-солнцам, излучающим свою живительную силу и духовность. Вы также можете найти ореолы в древнегреческом и римском искусстве, хотя сейчас они вышли из моды. Мастера эпохи Возрождения открыли период реализма, и нет ничего особенно реалистичного в диске, приклеенном к чьему-то затылку.

Но ореолы не исчезли! Винсент Ван Гог рисовал их в конце 1800-х по моде.«Я хочу изображать мужчин и женщин с тем чем-то вечным, что символизировал ореол, — сказал он однажды, — и что мы стремимся передать реальным сиянием и вибрацией наших красок… Ах! портретная живопись, портретная живопись с мысль, душа модели в ней, вот что, я думаю, должно прийти!»

Вы даже можете увидеть ореолы в комиксах о супергероях, олицетворяющие внутренние силы — посмотрите на примеры в этой истории ореолов в западном искусстве, если вы мне не верите.

Но я сбился с пути! Смотрите, вот что делают чертовы карты Таро Инквизиции! Они выбрасывают меня в интернет, пытаясь их расшифровать, а потом я ужасно теряюсь.С другой стороны, это хороший вид потерянного. Вы когда-нибудь слышали о Густаве Климте? Конечно есть! И человек, он занимается символизмом, грязная скотина! Вы когда-нибудь слышали об Альфонсе Мухе? Он был настолько хорош, что превращал театральные афиши и рекламные плакаты в самостоятельные шедевры в стиле модерн. Я бы не нашел их, если бы не потерялся. Эти карты таро Инквизиции помогают открывать искусство.

Далеко не все из них, но чтобы дать вам представление.

В общем, весь этот старый символизм можно увидеть в картах Таро Инквизиции.Возьмите фотографию Дориана — у него на голове желтый треугольник: на ней вы можете увидеть что-то, называемое Vesica Pisces. Это сакральная геометрия — перекрывающиеся круги, уходящие корнями в математику — и она стала означать что угодно, от рая и ада и между ними, до мандорлы (разновидность ореола) и вагины! Есть также жест рукой Vesica Pisces, когда два пальца указывают вверх — точно так же, как это делает Дориан на картинке.

Но хотя символы карт Таро, без сомнения, восходят к иконам, у них также есть свой собственный голос.Например, на карте Дориана один глаз спрятан, что оставляет ему всевидящее око. Треугольник на его голове — это интуиция и сила, исходящая из его чакры третьего глаза, о которой я слышал в йоге, а символ бесконечности, которого он касается, — это бесконечная природа энергии.

Но что именно все это значит, можно толковать — конечно! Именно так гадалкам на ярмарке удается брать ваши деньги и гадать, не говоря ничего конкретного.Одна из интерпретаций карты Волшебника Дориана, основанная на Reddit, гласит: «Число Волшебника — Один, число творения и индивидуальности. Его сила — преобразование посредством использования его воли. жизни, он показывает нам, что из основания мирского может возникнуть все, что грядет».

Другая женщина просматривает всю колоду Таро Инквизиции в сериале на YouTube и не только интерпретирует их значение, но и использует их, чтобы предсказать будущее Dragon Age! Я люблю это, все разрозненные дубли.Я имею в виду, это действительно раздражает, я бы хотел иметь удобное руководство по всей символике, но оно также сохраняет силу карт. Свести его к единственному решению значило бы лишить их мистического очарования.

Не только я одурманен. Посмотрите, как это отразится на сообществе BioWare. Pinterest и тому подобное заполнены фотографиями созданных людьми карт Таро. Они рисуют их для Dragon Age, они рисуют их для Mass Effect, хотя в Mass Effect вообще нет связи с Таро. Они вдохновлены, и с помощью Таро BioWare нашла совершенно новый способ связи.Посмотрите на символику фресок, найденных в дополнении Tresspasser для Inquisition, и на единственном изображении для Dragon Age 4. Это та же символика, которую вы можете увидеть в Таро, и теории о том, что она означает, неверны. глубокий (и такой захватывающий).

Хотели они того или нет, но BioWare действительно что-то придумали с картами Таро. Они вдохнули в игру мистическую жизнь и придали ей внешний вид, который, я надеюсь, сохранится навсегда. Они дают ему душу. Поэтому ответственным художникам — Рамилю Сунге, Касперу Конерфоллу, Нику Торнборроу и режиссеру Мэтту Роудсу — я выражаю самую скромную благодарность.Ваша работа прекрасна и важна для меня, она открыла для меня совершенно новый взгляд на искусство.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.