Лизатов бактерий смесь: Аптека Ригла – забронировать лекарства в аптеке и забрать самовывозом по низкой цене в Москва г.

Содержание

Лизатов бактерий смеси инструкция по применению, цена, аналоги, показания, совместимость, отзывы

Московское шоссе, д. 37 (1) пер. Камчатский, д.1 (1) пл. Комсомольская, д.6 (1) пл. Революции, д.5 (1) пл. Советская, остановка общ.транспорта (1) пр-кт Гагарина, д. 113 (1) пр-кт Героев, д. 26 (1) пр-кт Ленина, д. 2, пом. П11Б (1) пр-кт Ленина, д. 67 (1) пр-т. Бусыгина, д.19 (1) пр-т. Бусыгина, д.45А (1) пр-т. Гагарина, д.107 (1) пр-т. Гагарина, д.184 (1) пр-т. Гагарина, д.222 (1) пр-т. Гагарина, д.4 (1) пр-т. Гагарина, д.84 (1) пр-т. Кораблестроителей, д.22 (1) пр-т. Кораблестроителей, д.25 (1) пр-т. Кораблестроителей, д.4 (1) пр-т. Ленина, д.16 (1) пр-т. Ленина, д.28А (1) пр-т. Ленина, д.41 (1) пр-т. Ленина, д.44 (1) пр-т. Ленина, д.57 (1) пр-т. Октября, д.13 (1) пр-т. Октября, д.25 (1) пр. Гагарина, д. 48 (1) пр. Молодёжный, д. 19 (1) ул. 40 лет Победы, д. 4 (1) ул. Адмирала Макарова, д.3, к.2 (1) ул. Академика Сахарова, д.109 (1) ул. Артельная, д.5А (1) ул. Базарная, д.8 (1) ул. Баранова, д. 9 (1) ул. Батумская, д.1А (1) ул. Бекетова, д. 18 (1) ул. Бекетова, д. 66 (1) ул. Белинского, д.118/29 (1) ул. Белинского, д.87 (1) ул. Березовская, д. 111 (1) ул. Богородского, д.5, к.1 (1) ул. Большая Покровская, д.29 (1) ул. Большая Покровская, д.63 (1) ул. Бориса Корнилова, д.2 (1) ул. Бориса Панина, д.10 (1) ул. Бориса Панина, д.4 (1) ул. Бурденко, д.18 (1) ул. Буревестника, д.16 (1) ул. Васенко, д.3 (1) ул. Веденяпина, д.10 (1) ул. Веденяпина, д.18 (1) ул. Верхне-Печерская, д. 14 (1) ул. Верхне-Печерская, д.5 (1) ул. Военных Комиссаров, д.1 (1) ул. Волжская Набережная, д.25 (1) ул. Гаугеля, д.1 (1) ул. Генерала Ивлиева, д. 39 (1) ул. Генерала Ивлиева, д.33 (1) ул. Героя Прыгунова, д. 10 (1) ул. Горная, д.11 (1) ул. Движенцев, д.14 (1) ул. Долгополова, д.17/38 (1) ул. Дьяконова, д.20 (1) ул. Дьяконова, д.24А (1) ул. Есенина, д.14 (1) ул. Есенина, д.41 (1) ул. Ефремова, д. 16 (1) ул. Зайцева, д.17 (1) ул. Звездинка, д.3А (1) ул. Иванова Василия, д.14, к.1 (1) ул. Ижорская, д. 18 (1) ул. Карла Маркса, д. 16 (1) ул. Карла Маркса, д. 20 (1) ул. Карла Маркса, д.47 (1) ул. Касьянова, д.1 (1) ул. Коминтерна, д. 160 (1) ул. Коминтерна, д. 4/2 (1) ул. Коминтерна, д.172 (1) ул. Комсомольская, д.4 (1) ул. Космическая, д. 34, корп. 2 (1) ул. Космонавта Комарова, д.16 (1) ул. Краснодонцев, д.1 (1) ул. Краснодонцев, д.23 (1) ул. Краснодонцев, д.9 (1) ул. Краснозвездная, д.31 (1) ул. Куйбышева, д.1 (1) ул. Культуры, д. 13 (1) ул. Культуры, д.14 (1) ул. Культуры, д.3 (1) ул. Львовская, д.3 (1) ул. Львовская, д.7 (1) ул. Маршала Рокоссовского, д.4 (1) ул. Маршала Рокоссовского, д.8А (1) ул. Мончегорская, д. 16А, корп 1, пом п1 (1) ул. Мончегорская, д.15а (1) ул. Мончегорская, д.7А (1) ул. Народная, д.38 (1) ул. Ногина, д.9 (1) ул. Окская, д. 2 (1) ул. Переходникова, д. 29 (1) ул. Переходникова, ст.м. Пролетарская (1) ул. Плотникова, д. 5, пом. П009 (1) ул. Политбойцов, д.8 (1) ул. Полтавская, д.16 (1) ул. Республиканская, д.25 (1) ул. Родионова, д. 165, корп. 10 (1) ул. Родионова, д. 5 (1) ул. Родионова, д.189/24 (1) ул. Родионова, д.195 (1) ул. Романтиков, д. 5 (1) ул. Светлоярская, д.24 (1) ул. Светлоярская, д.32 (1) ул. Сергея Акимова, д.34 (1) ул. Сергея Есенина, д. 32 (1) ул. Снежная, д. 25А (1) ул. Телеграфная, д.3 (1) ул. Фруктовая, д.5 (1) ул. Чаадаева, д.28 (1) ул. Школьная, д.34 (1) ул. Щербинки I, д.11 (1) ул. Южное шоссе, д.16 (1) ул. Южное шоссе, д.44 (1) ул. Южное шоссе, д.28, к.1 (1) ул. Ярошенко, д.1 (1) ул.Коминтерна, д. 168 (1) ш. Казанское, д.5 (1) ш. Московское, д. 9 (1) ш. Московское, д.179 (1) ш. Южное, д. 21в (с ул.Старых производственников) (1) шоссе Казанское, д. 10, корп. 3 (1)

РазвернутьСвернуть

ИРС® 19

ИРС® 19

ПОДРАЗДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

ИРС® 19 (МНН: лизатов бактерий смесь)

Форма выпуска

Спрей назальный.

По 20 мл в баллон аэрозольный из бесцветного прозрачного низкощелочного стекла, покрытый защитным слоем пластика, находящийся под давлением азота, с клапаном непрерывного действия, в комплекте с насадкой из полиэтилена высокой плотности белого цвета. На баллон наклеивают самоклеящуюся этикетку или наносят маркировку на защитный слой пластика методом трафаретной или сухой офсетной печати.

1 баллон в комплекте с насадкой и инструкцией по применению помещают в картонную пачку.

Действующее вещество

Лизатов бактерий смесь [Streptococcuspneumoniae, typeI+Streptococcuspneumoniae, typeII,Streptococcuspneumoniae, typeIII, Streptococcuspneumoniae, typeV, Streptococcuspneumoniae, typeVIII, Streptococcuspneumoniae, typeXII+ Haemophilusinfluenzae, typeB+ Klebsiellapneumoniaesspneumoniae+ Staphylococcusaureusssaureus+ Acinetobactercalcoaceticus+ Moraxellacatarrhalis+ Neisseriasubflava+ Neisseriaperflava+ StreptococcuspyogenesgroupA+ StreptococcusdysgalactiaegroupC+ Enterococcusfaecium+ Enterococcusfaecalis+ StreptococcusgroupG]

Показания к применению

  • Профилактика хронических заболеваний верхних дыхательных путей и бронхов.
  • Лечение острых и хронических заболеваний верхних дыхательных путей ибронхов, таких как ринит, синусит, ларингит, фарингит, тонзиллит, трахеит,бронхит и др.
  • Восстановление местного иммунитета послеперенесенных гриппа и другихвирусных инфекций.
  • Подготовка к плановому оперативному вмешательству на ЛОР-органах и впослеоперационном периоде.

Узнать больше:  https://irs19.ru/ 

Скачать инструкцию

RUS2122120 от 20.08.2020

Сайт, на который вы собираетесь перейти, не принадлежит компании Abbott.

Ссылки, ведущие на веб-сайты, не принадлежащие компании Abbott, переводят вас на ресурсы третьих сторон, которые не находятся под контролем Abbott. Компания Abbott не несет ответственности за содержимое этих ресурсов и за ссылки, расположенные на них. Abbott предоставляет вышеупомянутые ссылки только для вашего удобства, при этом не подразумевая одобрение или поддержку веб-сайта, на который указывает данная ссылка.

Веб-сайт, на который вы собираетесь перейти, может быть не адаптирован под размер экрана вашего устройства.

Вы действительно хотите покинуть текущий сайт ?

Внимание! Вы переходите в раздел веб-сайта, содержащий информацию о лекарственных средствах, отпускаемых исключительно по рецепту врача, и/или медицинских изделий, для использования которых требуется специальная подготовка.

 

  • Согласно действующему законодательству РФ, вся информация этого раздела (далее Информация) может быть доступна исключительно для медицинских, фармацевтических работников и иных работников системы здравоохранения.
  • В связи с этим для доступа к такой Информации от вас требуется подтверждение вашего статуса и факта наличия у вас профессионального медицинского образования, а также того, что вы являетесь действующим медицинским, фармацевтическим работником или иным соответствующим профессионалом, обладающим соответствующими знаниями и навыками в области медицины, фармацевтики, диагностики и здравоохранения РФ.
  • Информация о лекарственных средствах и/или медицинских изделий компании Abbott, содержащаяся в настоящем разделе веб-сайта, предназначена исключительно для ознакомления, носит исключительно научно-информационный характер и не должна расцениваться в качестве Информации рекламного характера для широкого круга лиц.
  • Настоящим Вы, используя Информацию настоящего раздела, соглашается не воспринимать такую информацию о лекарственных средствах и/или медицинских изделий и не использовать ее в своих целях в качестве рекламы, обращенной к неопределенному кругу лиц, или иной запрещенной рекламы лекарственных средств и/или медицинских изделий в соответствии с законодательством РФ.
  • В любом случае Информация не должна быть использована для замены непосредственной консультации с врачом и для принятия решения о применении данных лекарственных средств и/или медицинских изделий самостоятельно.
  • Компания Abbott поддерживает настоящий веб-сайт, но не дает никаких поручительств или гарантий в отношении доступности, точности или полноты любой представленной Информации. Компания Abbott не берет на себя никаких обязательств или ответственности за любые ошибки или упущения в содержании настоящего веб-сайта.
  • Ни компания Abbott, ни любая другая сторона, участвовавшая в создании, написании или размещении Информации в настоящем разделе, не несет ответственности за любые прямые, случайные, косвенные, последовательные или штрафные убытки, возникающие из использования вами самостоятельно, в любом виде и целях Информации, размещенной в настоящем разделе.
  • Настоящим Вы соглашаетесь с обработкой Ваших персональных данных, в том числе сведений о Вашем статусе медицинского или фармацевтического работника.
  • В случае Вашего отказа от подтверждения Вашего статуса медицинского или фармацевтического работника, либо иного работника системы здравоохранения доступ в данные разделы настоящего веб-сайта, будет для Вас ограничен.

На основании вышесказанного, пожалуйста, подтвердите, что Вы являетесь действующим медицинским или фармацевтическим работником, либо иным работником системы здравоохранения, ознакомлены с Политикой в отношении обработки персональных данных, размещенной на веб-сайте компании Abbott, и настоящим даете свое согласие с вышеуказанными условиями.

ДА

Внимание! Вы переходите в раздел веб-сайта, содержащий информацию о лекарственных средствах, отпускаемых исключительно по рецепту врача, и/или медицинских изделий, для использования которых требуется специальная подготовка.

 

  • Согласно действующему законодательству РФ, вся информация этого раздела (далее Информация) может быть доступна исключительно для медицинских, фармацевтических работников и иных работников системы здравоохранения.
  • В связи с этим для доступа к такой Информации от вас требуется подтверждение вашего статуса и факта наличия у вас профессионального медицинского образования, а также того, что вы являетесь действующим медицинским, фармацевтическим работником или иным соответствующим профессионалом, обладающим соответствующими знаниями и навыками в области медицины, фармацевтики, диагностики и здравоохранения РФ.
  • Информация о лекарственных средствах и/или медицинских изделий компании Abbott, содержащаяся в настоящем разделе веб-сайта, предназначена исключительно для ознакомления, носит исключительно научно-информационный характер и не должна расцениваться в качестве Информации рекламного характера для широкого круга лиц.
  • Настоящим Вы, используя Информацию настоящего раздела, соглашается не воспринимать такую информацию о лекарственных средствах и/или медицинских изделий и не использовать ее в своих целях в качестве рекламы, обращенной к неопределенному кругу лиц, или иной запрещенной рекламы лекарственных средств и/или медицинских изделий в соответствии с законодательством РФ.
  • В любом случае Информация не должна быть использована для замены непосредственной консультации с врачом и для принятия решения о применении данных лекарственных средств и/или медицинских изделий самостоятельно.
  • Компания Abbott поддерживает настоящий веб-сайт, но не дает никаких поручительств или гарантий в отношении доступности, точности или полноты любой представленной Информации. Компания Abbott не берет на себя никаких обязательств или ответственности за любые ошибки или упущения в содержании настоящего веб-сайта.
  • Ни компания Abbott, ни любая другая сторона, участвовавшая в создании, написании или размещении Информации в настоящем разделе, не несет ответственности за любые прямые, случайные, косвенные, последовательные или штрафные убытки, возникающие из использования вами самостоятельно, в любом виде и целях Информации, размещенной в настоящем разделе.
  • Настоящим Вы соглашаетесь с обработкой Ваших персональных данных, в том числе сведений о Вашем статусе медицинского или фармацевтического работника.
  • В случае Вашего отказа от подтверждения Вашего статуса медицинского или фармацевтического работника, либо иного работника системы здравоохранения доступ в данные разделы настоящего веб-сайта, будет для Вас ограничен.

На основании вышесказанного, пожалуйста, подтвердите, что Вы являетесь действующим медицинским или фармацевтическим работником, либо иным работником системы здравоохранения, ознакомлены с Политикой в отношении обработки персональных данных, размещенной на веб-сайте компании Abbott, и настоящим даете свое согласие с вышеуказанными условиями.

[prod, crx3, samplecontent, publish, crx3tar]

Сайт, на который вы собираетесь перейти, не принадлежит компании Abbott.

Ссылки, ведущие на веб-сайты, не принадлежащие компании Abbott, переводят вас на ресурсы третьих сторон, которые не находятся под контролем Abbott. Компания Abbott не несет ответственности за содержимое этих ресурсов и за ссылки, расположенные на них. Abbott предоставляет вышеупомянутые ссылки только для вашего удобства, при этом не подразумевая одобрение или поддержку веб-сайта, на который указывает данная ссылка.

Веб-сайт, на который вы собираетесь перейти, может быть не адаптирован под размер экрана вашего устройства.

Вы действительно хотите покинуть текущий сайт ?

none

true

accessibility
© 2016 Abbott. All Rights Reserved. Please read the Legal Notice for further details.

Unless otherwise specified, all product and service names appearing in this Internet site are trademarks owned by or licensed to Abbott, its subsidiaries or affiliates. No use of any Abbott trademark, trade name, or trade dress in this site may be made without the prior written authorization of Abbott, except to identify the product or services of the company.

accessibility

Сайт, на который вы собираетесь перейти, не принадлежит компании Abbott.

Ссылки, ведущие на веб-сайты, не принадлежащие компании Abbott, переводят вас на ресурсы третьих сторон, которые не находятся под контролем Abbott. Компания Abbott не несет ответственности за содержимое этих ресурсов и за ссылки, расположенные на них. Abbott предоставляет вышеупомянутые ссылки только для вашего удобства, при этом не подразумевая одобрение или поддержку веб-сайта, на который указывает данная ссылка.

Веб-сайт, на который вы собираетесь перейти, может быть не адаптирован под размер экрана вашего устройства.

Вы действительно хотите покинуть текущий сайт ?

accessibility
© 2016 Abbott. All Rights Reserved. Please read the Legal Notice for further details.

Unless otherwise specified, all product and service names appearing in this Internet site are trademarks owned by or licensed to Abbott, its subsidiaries or affiliates. No use of any Abbott trademark, trade name, or trade dress in this site may be made without the prior written authorization of Abbott, except to identify the product or services of the company.

accessibility

Внимание! Вы переходите в раздел веб-сайта, содержащий информацию о лекарственных средствах, отпускаемых исключительно по рецепту врача, и/или медицинских изделий, для использования которых требуется специальная подготовка.

 

  • Согласно действующему законодательству РФ, вся информация этого раздела (далее Информация) может быть доступна исключительно для медицинских, фармацевтических работников и иных работников системы здравоохранения.
  • В связи с этим для доступа к такой Информации от вас требуется подтверждение вашего статуса и факта наличия у вас профессионального медицинского образования, а также того, что вы являетесь действующим медицинским, фармацевтическим работником или иным соответствующим профессионалом, обладающим соответствующими знаниями и навыками в области медицины, фармацевтики, диагностики и здравоохранения РФ.
  • Информация о лекарственных средствах и/или медицинских изделий компании Abbott, содержащаяся в настоящем разделе веб-сайта, предназначена исключительно для ознакомления, носит исключительно научно-информационный характер и не должна расцениваться в качестве Информации рекламного характера для широкого круга лиц.
  • Настоящим Вы, используя Информацию настоящего раздела, соглашается не воспринимать такую информацию о лекарственных средствах и/или медицинских изделий и не использовать ее в своих целях в качестве рекламы, обращенной к неопределенному кругу лиц, или иной запрещенной рекламы лекарственных средств и/или медицинских изделий в соответствии с законодательством РФ.
  • В любом случае Информация не должна быть использована для замены непосредственной консультации с врачом и для принятия решения о применении данных лекарственных средств и/или медицинских изделий самостоятельно.
  • Компания Abbott поддерживает настоящий веб-сайт, но не дает никаких поручительств или гарантий в отношении доступности, точности или полноты любой представленной Информации. Компания Abbott не берет на себя никаких обязательств или ответственности за любые ошибки или упущения в содержании настоящего веб-сайта.
  • Ни компания Abbott, ни любая другая сторона, участвовавшая в создании, написании или размещении Информации в настоящем разделе, не несет ответственности за любые прямые, случайные, косвенные, последовательные или штрафные убытки, возникающие из использования вами самостоятельно, в любом виде и целях Информации, размещенной в настоящем разделе.
  • Настоящим Вы соглашаетесь с обработкой Ваших персональных данных, в том числе сведений о Вашем статусе медицинского или фармацевтического работника.
  • В случае Вашего отказа от подтверждения Вашего статуса медицинского или фармацевтического работника, либо иного работника системы здравоохранения доступ в данные разделы настоящего веб-сайта, будет для Вас ограничен.

На основании вышесказанного, пожалуйста, подтвердите, что Вы являетесь действующим медицинским или фармацевтическим работником, либо иным работником системы здравоохранения, ознакомлены с Политикой в отношении обработки персональных данных, размещенной на веб-сайте компании Abbott, и настоящим даете свое согласие с вышеуказанными условиями.

Лизатов бактерий смеси — 2 отзыва, инструкция, аналоги, цена 725 руб.

Действующее вещество: Лизатов бактерий смеси проверить совместимость

Внимание! Лекарства пустышки — как разводят россиян или на что нельзя тратить деньги!

Названия
 Русское название: Лизатов бактерий смеси.
 Английское название: Streptococcus pneumoniae, type I+Streptococcus pneumoniae, type II+Streptococcus pneumoniae, type III+Streptococcus pneumoniae, type V+Streptococcus pneumoniae, type VIII+Streptococcus pneumoniae, type XII+Haemophilus.

Латинское название
 ( ).

ATX код
 R07AX Препараты для лечения заболеваний органов дыхания другие.

Характеристика вещества
 Комплексный препарат из лизатов бактерий.

Фармакологическое действие
 Фармакологическое действие — повышающее специфический и неспецифический иммунитет.

Фармакодинамика
 ИРС 19 повышает специфический и неспецифический иммунитет. При распылении ИРС 19 образуется мелкодисперсный аэрозоль, который покрывает слизистую оболочку носа, что приводит к быстрому развитию местного иммунного ответа. Специфическая защита обусловлена локально образующимися антителами класса секреторных иммуноглобулинов типа А(IgA), препятствующими фиксации и размножению возбудителей инфекции на слизистой. Неспецифическая иммунозащита проявляется в повышении фагоцитарной активности макрофагов и увеличении содержания лизоцима. Показания к применению
 Профилактика хронических заболеваний верхних дыхательных путей и бронхов;
 Лечение острых и хронических заболеваний верхних дыхательных путей и бронхов (ринит, синусит, ларингит, Фарингит, тонзиллит, трахеит, бронхит) и тд;;
 Восстановление местного иммунитета после перенесенных гриппа и других вирусных инфекций;
 Подготовка к плановому оперативному вмешательству на лор-органах и в послеоперационном периоде.

Противопоказания
 Повышенная чувствительность к препарату или его компонентам в анамнезе;
 Аутоиммунные заболевания.

Применение при беременности и кормлении грудью
 Не рекомендуется во время беременности (данные о потенциальной возможности тератогенного или токсического влияния на плод отсутствуют).

Побочные эффекты
 Во время приема ИРС 19 могут отмечаться следующие побочные эффекты как связанные, так и не связанные с действием препарата.
 Кожные реакции. В редких случаях возможны реакции гиперчувствительности (крапивница, ангионевротический отек) и кожные эритемоподобные и экземоподобные реакции.
 Со стороны лор-органов и органов дыхания. Редко — приступы астмы и кашель.
 В редких случаях в начале лечения могут наблюдаться — повышение температуры тела (≥39 °C) без видимых причин, тошнота, рвота, боль в животе, диарея, ринофарингит, синусит, ларингит, бронхит.
 Описаны единичные случаи появления тромбоцитопенической пурпуры и узловатой Эритемы.
 При появлении вышеуказанных симптомов рекомендуется обратиться к врачу.

Взаимодействие
 Случаи негативного взаимодействия с другими ЛС неизвестны. В случае появления клинических симптомов бактериальной инфекции возможно назначение антибиотиков на фоне продолжающегося применения ИРС 19.

Передозировка
 Случаи передозировки неизвестны.

Меры предосторожности применения
 Применение ИРС 19 не оказывает влияния на психомоторные функции, связанные с вождением автомобиля или управлением машинами и механизмами.

Особые указания
 При назначении препаратов на основе бактериальных лизатов с целью иммуностимуляции больным бронхиальной астмой возможно появление приступов астмы. В этом случае рекомендуется прекратить лечение и не принимать препараты этого класса в будущем.
 Меры предосторожности при применении.
 Флакон-спрей:
 - беречь от нагревания свыше 50 °C и от попадания прямого солнечного света;
 - не прокалывать флакон;
 - не сжигать флакон, даже если он пустой.

Дополнительные факты
 Описание было автоматически дополнено из инструкции препарата «ИРС 19», поскольку у самого действующего вещества нет подробного описания.

👨‍⚕Рекомендации / отзывы врачей: у нас на сайте есть большой раздел консультаций, где 138 раз пациентами и врачами обсуждается препарат Лизатов бактерий смеси — посмотреть советы врачей

Госзакупки 44-ФЗ и 223-ФЗ: ЛИЗАТОВ БАКТЕРИЙ СМЕСЬ

Мои тендеры

Поиск предстоящих тендеров

Прошедшие тендеры

0318100030020000147

Вид торгов: Электронный аукцион
Площадка: АО «Сбербанк-АСТ» (http://www.sberbank-ast.ru)
Заказчик: ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «МЕДИКО-САНИТАРНАЯ ЧАСТЬ № 23 ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ИСПОЛНЕНИЯ НАКАЗАНИЙ»
ИНН/КПП заказчика: 2319027466/231201001
ОГРН заказчика: 1022302837040
Юридический адрес заказчика:
Почтовый адрес заказчика: Российская Федерация, 350007, Краснодарский край, Краснодар г, УЛ ЗАХАРОВА, ДОМ 11А
Телефон: 7-861-2670401
Факс:
Контактное лицо: ДАЦКО ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА
Название процедуры: ЛИЗАТОВ БАКТЕРИЙ СМЕСЬ
Начальная цена: 7 752,00
Дата окончания подачи: 01.10.2020 10:00
Дата процедуры: 05.10.2020 00:00
Отрасли: 21 — Средства лекарственные и материалы, применяемые в медицинских целях
Наименование Количество Единица измерения ОКПД2 Цена за единицу Сумма
0 ЛИЗАТОВ БАКТЕРИЙ СМЕСЬ [STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, TYPE I+STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, TYPE II+STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, TYPE III+STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, TYPE V+STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, TYPE VIII+STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, TYPE XII+HAEMOPHILUS INFLUENZAE, TYPE B+KLEBSIELLA PNEUMONIAE SS PNEUMONIAE+STAPHYLOCOCCUS AUREUS SS AUREUS+ACINETOBACTER CALCOACETICUS+MORAXELLA CATARRHALIS+NEISSERIA SUBFLAVA+NEISSERIA PERFLAVA+STRPTOCOCCUS PYOGENES GROUP A+STREPTOCOCCUS DYSGALACTIAE GRPUP C+ENTEROCOCCUS FAECIUM+ENTEROCOCCUS FAECALIS+STREPTOCOCCUS GROUP G] 300.миллилитр 21. 0,00 0,00

Победитель:

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ «ЛЕСАН ФАРМА», ИНН: 6161051021
Сумма контракта: 7 752,00
Контактное лицо:

Смесь бактериальных механических лизатов более эффективна, чем лизат одного штамма, и растворимые продукты бактериального происхождения для индукции активирующего фенотипа в дендритных клетках человека

Реферат

Дендритные клетки (ДК) после оптимального созревания способны для стимулирования эффективного иммунного ответа. Для этого обе костимулирующие молекулы (CD80 и CD86), активирующие молекулы (CD83) и молекулы, представляющие пептид (HLA), чрезмерно экспрессируются. Обработка in vitro незрелых DC фрагментами бактериальных штаммов, полученных с помощью механического лизиса, а также молекулами бактериального происхождения (такими как липополисахарид и протидогликан), индуцировала созревание DC и секрецию панели цитокинов. и хемокины.Следует отметить, что обработанные ex vivo циркулирующие DC и плазмацитоидные DC также активировались этими бактериальными тельцами. Однако, хотя фракция частиц отдельных штаммов бактерий или растворимых молекул бактериального происхождения вызывала субоптимальное созревание (что оценивается по экспрессии активирующего фенотипа на ДК и количеству секреции цитокинов), добавление смеси частиц фракции различных бактериальных штаммов были способны опосредовать оптимальное созревание. Эти результаты были также подтверждены при использовании секреции как цитокинов, так и хемокинов в качестве маркеров активации DC.Все эти результаты предполагают, что фракция микрочастиц смесей бактериальных лизатов, из-за их способности взаимодействовать с различными поверхностными структурами, может использоваться не только как иммуноген, но и как адъювантное лечение для усиления иммунного ответа на плохо «антигенные» белки, такие как раковые антигены или аллергены.

Основные моменты

► Мы оценили паттерны активации различных субпопуляций дендритных клеток после совместного культивирования с отдельными бактериями, бактериальной смесью и растворимыми бактериальными белками.► Смесь была наиболее сильной, в то время как отдельные бактерии и растворимые продукты были слабее. ► Секреция цитокинов подтверждает это свидетельство. ► Мы пришли к выводу, что смесь бактериальных лизатов может использоваться не только для получения специфического иммунного ответа, но и в качестве адъюванта для усиления слабоантигенных белков.

Ключевые слова

Дендритные клетки

Цитокины

Хемокины

Бактериальные лизаты

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

Copyright © 2011 Elsevier B.V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Влияние поливалентного механического бактериального лизата на количество и активность лимфоцитов у детей с астмой: рандомизированное контролируемое исследование | Аллергия, астма и клиническая иммунология

Это исследование было частью EOLIA (Эффективность механического бактериального лизата у детей с аллергией, NCT02541331), клинического исследования клинического течения астмы и связанных иммунологических параметров у детей с астмой.Это было рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое исследование с параллельными группами, которое проводилось в Польше с июля 2014 года по июнь 2015 года [12].

Протокол исследования был одобрен Комитетом по биоэтике Медицинского университета Люблина (номер резолюции Комитета по биоэтике KE-0254/140/2014) и проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией. Письменное информированное согласие было получено от родителей пациентов до включения в исследование, и подписанное согласие было получено от всех пациентов.

Популяция исследования была педиатрической (от 6 до 15 лет) с аллергической астмой и аллергией на клещей домашней пыли (HDM), подтвержденной положительным кожным уколом (Allergopharma-Nexter Sp. Z oo — Польша) или повышенным уровнем анти-IgE в сыворотке. специфический уровень с аллергенами HDM (Polycheck®, Biocheck-GmbH, EMMA-MDT Sp. z oo — Польша). В подгруппу биологии были включены 49 пациентов Детской больницы Люблина, 21 и 28 пациентов в группах PMBL® и плацебо, соответственно. Аллергия на HDM в этой подгруппе была подтверждена положительными тестами на кожные уколы (SPT) у 42 детей, повышенным уровнем специфического IgE в сыворотке у 4 детей или с обоими методами у 3 детей.

Таблетка PMBL® (Ismigen®, Lallemand Pharma AG, Massagno, Швейцария) содержит 7 мг бактериального лизата следующих бактерий: Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes , Streptococcus ( viridans , oralis ) oralis Klebsiella pneumoniae , Klebsiella ozaenae , Haemophilus influenzae серотипа B , Neisseria catarrhalis и Streptococcus (Diplococcus) pneumoniae (шесть штаммов).Пациенты получали сублингвально по одной таблетке в день до прекращения голодания в первые 10 дней каждого месяца в течение трех месяцев подряд. Лекарства были предоставлены спонсором, это был тот же самый продукт, который коммерчески доступен на рынке. Таблетки давали родители дома.

Основными критериями включения были: диагноз аллергической астмы в соответствии с рекомендациями GINA с аллергией на клещей домашней пыли (HDM) до скрининга [19, 20]; частично контролируемая или неконтролируемая астма до посещения скрининга; лечение ингаляционными кортикостероидами (ICS) и бета-агонистами короткого действия (SABA), используемыми против одышки, или ICS с бета-агонистами длительного действия (LABA) в течение предыдущих трех месяцев; и как минимум два обострения астмы в течение 12 месяцев до исследования.

Обострения оценивались и подтверждались исследователем на основании ухудшения симптомов и временного изменения лечения. Тяжесть обострения астмы определялась как:

  1. . 1.

    Легкая / умеренная, если требуется временное повышение ИКС / β2-агонистов / антихолинергических препаратов в течение ≥ 2 дней или посещение отделения неотложной помощи, но без назначения системных кортикостероидов.

  2. 2.

    Тяжелая, если требуется госпитализация или посещение отделения неотложной помощи и системные кортикостероиды должны быть назначены или системные кортикостероиды (пероральные или парентеральные) должны быть назначены в течение ≥ 3 дней, но <7 дней.

Все критерии включения и исключения были недавно опубликованы [12].

Все дети лечились от астмы постоянными дозами ICS или ICS с LABA и SABA по мере необходимости в течение всего периода исследования [20].Пациенты, которым проводилась иммуностимуляция бактериальным лизатом и / или аллерген-иммунотерапия в течение предыдущих 6 месяцев перед скринингом, были исключены. Кроме того, вакцинация против гриппа, хроническая фармакотерапия систематическими кортикостероидами или антагонистами рецепторов лейкотриена были запрещены в течение периода лечения.

Согласно списку рандомизации, номера лечения были присвоены PMBL® или плацебо. Подмножество биологических анализов было выполнено до начала лечения (исходный уровень) и через 12 недель после последнего периода приема таблеток.

Иммунологические параметры

При включении и через 12 недель после приема последней таблетки оценивали общий анализ крови. Это включало эритроциты, лейкоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты) и количество тромбоцитов. Были описаны следующие фенотипы лимфоцитов (количество и% лимфоцитов):

  • Лимфоциты CD45 + (общий лейкоцитарный антиген, CD45 +),

  • Т-лимфоцитов (CD3 +), поздно активированных Т-лимфоцитов (CD3 + CD25 +), рано активированных Т-лимфоцитов (CD3 + CD69 +),

  • Т-хелперные лимфоциты (CD3 + CD4 +), поздно активированные Т-хелперные лимфоциты (CD4 + CD25 +, CD4 + CD25 + высокий), рано активированные Т-хелперные лимфоциты (CD4 + CD69 +),

  • T рег лимфоцитов (CD4 + CD25 + FOXP3),

  • Т цитотоксических лимфоцитов (CD3 + CD8 +), поздно активированных Т цитотоксических лимфоцитов (CD8 + CD25 +), рано активированных цитотоксических лимфоцитов Т (CD8 + CD69 +),

  • NK-подобных Т-лимфоцитов (CD3 + CD56 + CD16 +),

  • NK-клеток (CD3-CD16 + CD56 +).

Проточный цитометрический анализ фенотипа T, B и NK-клеток на исходном уровне и через 12 недель наблюдения

Определение абсолютного количества субпопуляций лимфоцитов проводилось с помощью программного обеспечения проточной цитометрии на основе дифференциальной экспрессии CD45 + и других поверхностных антигенов на изучать клетки. Проточный цитометр использовали для определения представляющих интерес клеток в процентах от «эталонной» популяции. Затем гематологический анализатор предоставил абсолютное количество лимфоцитов, что позволило определить абсолютное количество лимфоцитов CD45 +.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) собирали с помощью пипеток Пастера и дважды промывали PBS, не содержащим Ca2 + Mg2 +, в течение 5 мин. После центрифугирования в градиенте плотности PBMC подвергали двухцветной или трехцветной маркировке соответствующими количествами моноклональных антител в соответствии с инструкциями производителя. Выделенную суспензию клеток делили на отдельные пробирки по 1 × 10 6 / образец и инкубировали с моноклональными антителами. К каждому образцу оцениваемых клеток добавляли 20 мкл антител и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин.После инкубации клетки дважды промывали PBS (при 700 г, 5 мин) и сразу же анализировали с помощью проточного цитометра FACS Canto II (Becton Dickinson, США), оснащенного двумя лазерами с длиной волны 488 нм и 633 нм. Сбор данных проводился с помощью специализированного программного обеспечения FACS Diva Software 6.1.3 (Becton Dickinson, США). Данные анализировали с помощью CellQuest Pro (Becton Dickinson, США). Калибровочная система CaliBRITE (Becton Dickinson, США) использовалась для оптимизации настроек проточного цитометра. Программное обеспечение BD FACSDiva собирает данные из каждой контрольной трубки компенсации и автоматически рассчитывает точные значения компенсации для каждой комбинации флуорохромов.Затем средние интенсивности флуоресценции (MFI) положительной и отрицательной популяций компенсационного контроля были выровнены в соседних каналах. Для каждого образца данные были получены путем обычного сбора 30000 событий в воротах лимфоцитов (область R1) на точечной диаграмме прямого рассеяния (FSc) / бокового рассеяния (SSc). Популяции клеток определяли по разнице в размере и зернистости клеток. Это позволило исключить из анализа эритроциты, тромбоциты, мертвые клетки и клеточные фрагменты.Меченые клетки регистрировали на основе созданных лимфоцитов, чистоту которых оценивали на основе распределения клеток относительно системы координат CD45 FITC / CD14 PE. Оценивали долю положительно меченых клеток. Для получения положительного результата мы искали изменение интенсивности между отрицательным контролем и положительными образцами. Результаты проточной цитометрии представляли как долю клеток, окрашенных моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцентными маркерами или флуорохромами.Использовали антитела против CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD25 +, CD69 +, FOXP3 +, конъюгированные с их соответствующими флуорохромами FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy ™ 5.5, PE-Cy ™ 7, APC, APC-Cy7.

Статистический анализ

Все данные были введены в базу данных только для записи. Изменение каждого лабораторного параметра по сравнению с исходным уровнем описывалось и сравнивалось внутри- и межгрупповыми тестами с использованием t-критерия Стьюдента. В случае ненормальности (оцениваемой по критерию Шапиро-Уилка) применялся тест Вилкоксона.Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SAS (версия 9.4 для Windows). Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

ВОЗМОЖНОСТИ ИММУНОМОДУЛЯТОРА НА СМЕСИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИЗАТОВ В ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

ВОЗМОЖНОСТИ ИММУНОМОДУЛЯТОРА НА СМЕСИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИЗАТОВ В ПЕДИАТРИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Эрдес С.И., Ревякина С.А.

Аннотация

Проанализированы результаты клинических исследований эффективности смеси лизатов бактерий (Имудон) в педиатрической практике.Полученные данные показывают целесообразность применения препарата у детей с рецидивирующими заболеваниями органов дыхания, инфекциями глотки и миндалин, герпетическим стоматитом, острым ларингитом и удалением миндалин. Ключевые слова: дети, смесь бактериальных лизатов, клинические испытания, обзор. (Вопросы современной педиатрии — Современная педиатрия) 2010; 9 (6): 63-68.

Темы: Педиатрия, RJ1-570

Издательство: ООО «Педиатр»

Год: 2010

Идентификатор OAI: оаи: додж.org / article: a440c6062b744647b759f1a32018c646

Скачать PDF:
К сожалению, мы не можем предоставить полный текст, но вы можете найти его на следующий адрес (а):
  • https: //vsp.spr-journal.ru/jou … (внешний связь)
  • https: // doaj.org / toc / 1682-5527 (внешний связь)
  • https: //doaj.org/article/a440c … (внешний связь)
  • https://doaj.org/toc/1682-5535 (внешний связь)
  • ключевых шагов в протоколах очистки плазмид

    Приготовление клеточного лизата
    Выход ДНК зависит от качества используемого клеточного лизата.Поэтому приготовление очищенного клеточного лизата является важным этапом процедуры очистки QIAGEN, которая была тщательно разработана для обеспечения оптимальных условий лизиса.

    После сбора и ресуспендирования бактериальные клетки лизируют в NaOH-SDS (буфер P2) в присутствии РНКазы A. SDS солюбилизирует фосфолипидные и белковые компоненты клеточной мембраны, что приводит к лизису и высвобождению содержимого клетки. NaOH денатурирует хромосомную и плазмидную ДНК, а также белки. Оптимизированное время лизиса обеспечивает максимальное высвобождение плазмидной ДНК из клетки без высвобождения хромосомной ДНК, связанной с клеточной стенкой, при минимальном воздействии на плазмиду денатурирующих условий.Длительное воздействие щелочных условий может привести к необратимой денатурированию плазмиды. Эта денатурированная форма плазмиды быстрее работает на агарозных гелях и устойчива к перевариванию рестрикционными ферментами. Лизат нейтрализуется добавлением кислого ацетата калия (буфер P3). Высокая концентрация соли вызывает осаждение KDS *, и денатурированные белки, хромосомная ДНК и клеточный дебрис попадают в ловушку комплексов соль-детергент. Плазмидная ДНК, будучи меньше по размеру и ковалентно закрытой, правильно ренатурирует и остается в растворе.Поскольку любой SDS, оставшийся в лизате, будет препятствовать связыванию ДНК со смолой QIAGEN, раствор необходимо тщательно, но осторожно перемешать, чтобы обеспечить полное осаждение детергента.
    * Додецилсульфат калия.

    Отделение плазмиды от хромосомной ДНК основано на соосаждении хромосомной ДНК, связанной с клеточной стенкой, с нерастворимыми комплексами, содержащими соль, детергент и белок. Плазмидная ДНК остается в прозрачном супернатанте. Энергичная обработка во время процедуры лизиса приведет к срезанию бактериальной хромосомы, в результате чего в супернатанте останутся свободные фрагменты хромосомной ДНК.Поскольку хромосомные фрагменты химически неотличимы от плазмидной ДНК в используемых условиях, эти два вида не будут разделены на смоле QIAGEN и будут элюироваться в одинаковых солевых условиях. РНКаза А, которая добавляется в начале процедуры, эффективно переваривает высвободившуюся РНК во время щелочного лизиса. Полученные фрагменты РНК не связываются со смолой QIAGEN в условиях соли и pH, присутствующих в лизате. Осажденный мусор удаляют центрифугированием или использованием картриджа QIAfilter, получая очищенный лизат для загрузки на наконечник QIAGEN.На этой стадии важно, чтобы лизат был прозрачным, чтобы обеспечить хорошую скорость потока и, в конечном итоге, получить препараты плазмидной ДНК, не содержащие белков.

    Очистка лизатов бактерий с помощью картриджей QIAfilter
    Картриджи QIAfilter — это специальные фильтрующие устройства, предназначенные для замены этапа центрифугирования после щелочного лизиса бактериальных клеток. После осаждения культур бактериальные клетки лизируют в NaOH-SDS, нейтрализуют добавлением кислого ацетата калия и инкубируют непосредственно в картридже QIAfilter.Лизат очищается за секунды, пропуская жидкость через фильтр. Нерастворимые комплексы, содержащие хромосомную ДНК, соль, детергент и белки, которые образуются на стадии нейтрализации, полностью удаляются. Картриджи QIAfilter очищают лизаты бактерий более эффективно, чем обычное центрифугирование. Кроме того, мелкие осадки SDS, которые нельзя отделить центрифугированием, полностью удаляются с помощью картриджа QIAfilter.

    Связывание ДНК и промывка на наконечнике QIAGEN
    Очищенный лизат загружают на предварительно уравновешенную насадку QIAGEN под действием силы тяжести.Солевые и pH-условия лизата и превосходная селективность смолы QIAGEN гарантируют, что связывается только плазмидная ДНК, в то время как деградированная РНК, клеточные белки и метаболиты не удерживаются и не появляются в проточной фракции. Затем наконечник QIAGEN промывают буфером со средним содержанием соли (Buffer QC), который полностью удаляет любые оставшиеся загрязнения, такие как следы РНК и белка (например, РНКазы A), не влияя на связывание плазмидной ДНК. Буфер QC также нарушает неспецифические взаимодействия и позволяет удалять белки, связывающие нуклеиновые кислоты, без использования фенола.Низкая концентрация спирта в промывочном буфере устраняет неспецифические гидрофобные взаимодействия, дополнительно повышая чистоту связанной ДНК. Затем плазмидная ДНК эффективно элюируется с наконечника QIAGEN с помощью буфера с высоким содержанием соли (буфер QF или QN).

    Обессоливание и концентрирование центрифугированием
    Элюированную плазмидную ДНК обессоливают и концентрируют осаждением изопропанолом. Осаждение проводят при комнатной температуре, чтобы свести к минимуму соосаждение соли. После центрифугирования осадок ДНК промывают 70% этанолом для удаления остаточной соли и замены изопропанола этанолом, который является более летучим и легко удаляется.Очищенную ДНК в течение короткого времени сушат на воздухе и повторно растворяют в небольшом объеме буфера ТЕ, pH 8,0 или Tris • Cl, pH 8,5, и ее можно использовать для трансфекции, секвенирования, мечения, клонирования или любой другой экспериментальной процедуры.

    Обессоливание и концентрирование с помощью модуля осаждения QIA
    Элюированную плазмидную ДНК смешивают с изопропанолом и наносят на модуль преципитатора QIA с помощью шприца, входящего в комплект. Модуль улавливает осажденную ДНК во время прохождения смеси изопропанола.Рекомендуется дополнительная стадия промывки этанолом, чтобы максимизировать чистоту ДНК. Осажденная ДНК улавливается в преципитаторе QIA в виде тонкого слоя, что позволяет полностью высушить и удалить этанол путем простого проталкивания воздуха через преципитатор QIA с помощью шприца. Затем ДНК элюируют из преципитатора QIA в пробирку для микроцентрифуги с буфером TE, входящим в комплект. В качестве альтернативы можно использовать любой обычный буфер или воду. ДНК следует хранить при –20 ° C при элюировании водой, поскольку ДНК может разлагаться в отсутствие буферного раствора и хелатирующего агента.ДНК готова к использованию для трансфекции, секвенирования, маркировки, клонирования или любой другой экспериментальной процедуры.

    Репликация ДНК в Escherichia coli

    Введение

    Исследования бактериальной трансформации и бактериальной инфекции 1–5 убедительно показывают, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) может нести и передавать наследственную информацию и может управлять собственной репликацией. Гипотезы о механизме репликации ДНК различаются предсказаниями, которые они делают относительно распределения среди дочерних молекул атомов, происходящих от родительских молекул. 6

    Радиоизотопные метки использовались в экспериментах, касающихся распределения родительских атомов среди дочерних молекул в нескольких организмах. 6–9 Мы ожидали, что метка, которая придает молекуле ДНК повышенную плотность, может позволить анализ этого распределения методами седиментации. С этой целью был разработан метод обнаружения небольших различий в плотности макромолекул. 10 Используя этот метод, мы наблюдали распределение тяжелого изотопа азота N 15 среди молекул ДНК после переноса равномерно меченой N 15 , экспоненциально растущей популяции бактерий в среду для роста, содержащую изотоп азота обыкновенный N 14 .

    Центрифугирование с градиентом плотности

    Небольшое количество ДНК в концентрированном растворе хлорида цезия центрифугируют до достижения равновесия. Противоположные процессы седиментации и диффузии затем привели к стабильному градиенту концентрации хлорида цезия. Градиенты концентрации и давления приводят к непрерывному увеличению плотности в направлении центробежной силы. Макромолекулы ДНК, присутствующие в этом градиенте плотности, движутся центробежным полем в область, где плотность раствора равна их собственной плавучей плотности. 11 Этой тенденции к концентрации противостоит диффузия, в результате чего в равновесии один вид ДНК распределяется по полосе, ширина которой обратно пропорциональна молекулярной массе этого вида (рис. 1).

    Рис. 1.

    Фотографии поглощения ультрафиолетового излучения, показывающие последовательные стадии связывания ДНК из E. coli . Аликвоту бактериального лизата, содержащую приблизительно 10 8 лизированных клеток, центрифугировали при 31 410 об / мин в растворе CsCl, как описано в тексте.Расстояние от оси вращения увеличивается вправо. Число рядом с каждой фотографией показывает время, прошедшее после достижения 31 410 об / мин.

    Если присутствует несколько видов ДНК с разной плотностью, каждый из них образует полосу в том месте, где плотность раствора CsCl равна плавучей плотности этого вида. Таким образом ДНК, меченная тяжелым азотом (N 15 ), может быть отделена от немеченой ДНК. На рис. 2 показаны две полосы, образованные в результате центрифугирования смеси приблизительно равных количеств ДНК N 14 и N 15 Escherichia coli .

    Рис. 2.

    a: Разрешение ДНК N 14 из ДНК N 15 центрифугированием в градиенте плотности. Смесь бактериальных лизатов N 14 и N 15 , каждый из которых содержит примерно 10 8 лизированных клеток, центрифугировали в растворе CsCl, как описано в тексте. Фотография была сделана после 24 часов центрифугирования при 44 770 об / мин. b: Микроденситометр, показывающий распределение ДНК в области двух полос на рис.2 а . Расстояние между пиками соответствует разнице в плавучей плотности 0,014 г. см. -3

    В этой статье будет сделана ссылка на кажущуюся молекулярную массу образцов ДНК, определенную с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Обсуждены 10 соображения, на которых основаны такие определения, а также несколько возможных источников ошибок. 12

    Экспериментальный

    Escherichia coli B выращивали при 36 ° C.с аэрацией в среде солей глюкозы, содержащей хлорид аммония в качестве единственного источника азота. 13 Рост бактериальной популяции отслеживали с помощью микроскопического подсчета клеток и анализа колоний (рис. 3).

    Рис. 3.

    Рост бактериальных популяций сначала в среде N 15 , а затем в среде N 14 . Значения на ординатах дают фактические титры культур до момента добавления N 14 . После этого, в течение периода, когда образцы отбирали для центрифугирования в градиенте плотности, фактический титр поддерживался между 1 и 2 × 10 8 путем добавления свежей среды.Значения на ординатах в этот более поздний период были скорректированы с учетом изъятий и добавлений. В течение периода отбора проб для центрифугирования в градиенте плотности время генерации составляло 0,81 часа в эксперименте 1 и 0,85 часа в эксперименте 2.

    Бактерии, равномерно помеченные N 15 , получали выращиванием промытых клеток в течение 14 поколений (до титра 2 × 10 8 / мл) в среде, содержащей 100 мкг / мл N 15 H 4 Cl изотопной чистоты 96,5%.Затем резкое изменение среды N 14 осуществляли путем добавления к растущей культуре десятикратного избытка N 14 H 4 Cl вместе с рибозидами аденина и урацила в эксперименте 1 и рибозидами аденина. гуанин, урацил и цитозин в эксперименте 2, чтобы получить концентрацию 10 мкг / мл каждого рибозида. Во время последующего роста бактериальный титр поддерживался между 1 и 2 × 10 8 / мл за счет соответствующих добавлений свежей среды N 14 , содержащей рибозиды.

    Образцы, содержащие около 4 × 10 9 бактерий, отбирали из культуры непосредственно перед добавлением N 14 и впоследствии с интервалами для нескольких поколений. Каждый образец немедленно охлаждали и центрифугировали на холоду в течение 5 минут при 1800 × g . После ресуспендирования в 0,40 мл. холодного раствора 0,01 M в NaCl и 0,01 M в этилендиаминтетра-ацетате (EDTA) при pH 6, клетки лизировали добавлением 0,10 мл.15% додецилсульфата натрия и хранят на холоде.

    Для центрифугирования в градиенте плотности 0,010 мл. лизата додецилсульфата добавляли к 0,70 мл. раствора CsCl, забуференного при pH 8,5 0,01 M трис (гидроксиметил) аминометаном. Плотность полученного раствора составляла 1,71 г. см. -3 Его центрифугировали при 140000 × g . (44 770 об / мин) в ультрацентрифуге Spinco, модель E, при 25 ° в течение 20 часов, за это время ДНК практически достигла седиментационного равновесия.Затем были обнаружены полосы ДНК в области плотностью 1,71 мкм. см. -3 , хорошо изолирован от всех других макромолекулярных компонентов бактериального лизата. Фотографии поглощения ультрафиолетового излучения, сделанные во время каждого центрифугирования, сканировали с помощью записывающего микроденситометра (рис. 4).

    Рис. 4.

    a: Фотографии поглощения ультрафиолетового излучения, показывающие полосы ДНК, полученные в результате центрифугирования в градиенте плотности лизатов бактерий, взятых в разное время после добавления избытка субстратов N 14 к растущему N 15 — меченая культура.Каждая фотография была сделана после 20 часов центрифугирования при 44 770 об / мин в условиях, описанных в тексте. Плотность раствора CsCl увеличивается вправо. Области одинаковой плотности занимают одинаковое положение по горизонтали на каждой фотографии. Время выборки отсчитывается от времени добавления N 14 в единицах времени генерации. Время генерации для экспериментов 1 и 2 оценивали на основе измерений роста бактерий, представленных на фиг. 3. Микроденситометрические записи b: полос ДНК, показанные на соседних фотографиях.Смещение пера микроденситометра над базовой линией прямо пропорционально концентрации ДНК. Степень мечения вида ДНК соответствует относительному положению его полосы между полосами полностью меченой и немеченой ДНК, показанными в самой нижней рамке, которая служит эталоном плотности. Проверка вывода о том, что ДНК в полосе промежуточной плотности просто наполовину помечена, обеспечивается рамкой, показывающей смесь поколений 0 и 1.9. Когда делается поправка на относительные количества ДНК в трех пиках, пик промежуточной плотности оказывается центрированным на 50 ± 2% расстояния между пиками N 14 и N 15 .

    Можно ожидать, что плавучесть молекулы ДНК будет напрямую зависеть от доли метки N 15 , которую она содержит. Градиент плотности постоянен в области между полностью мечеными и немечеными полосами ДНК. Следовательно, степень мечения частично меченого вида ДНК может быть определена непосредственно по относительному положению его полосы между полосой полностью меченой ДНК и полосой немеченой ДНК. Погрешность этой процедуры определения степени маркировки оценивается примерно в 2%.

    Результаты

    На рисунке 4 показаны результаты центрифугирования в градиенте плотности лизатов бактерий, отобранных в разное время после добавления избытка субстратов, содержащих N 14 , к растущей культуре, меченной N 15 .

    На Рисунке 4 можно увидеть, что до тех пор, пока не истечет время одного поколения, полумеченые молекулы накапливаются, в то время как полностью меченая ДНК истощается. Через один раз после добавления N 14 наблюдаются только эти полумеченые или «гибридные» молекулы.Впоследствии обнаруживаются только наполовину меченая ДНК и полностью немеченая ДНК. По прошествии двух периодов генерации после добавления N 14 полумеченная и немеченая ДНК присутствуют в равных количествах.

    Обсуждение

    Эти результаты позволяют сделать следующие выводы относительно репликации ДНК в условиях настоящего эксперимента.

    1. Азот молекулы ДНК делится поровну между двумя субъединицами, которые остаются неизменными на протяжении многих поколений.

    Наблюдение за тем, что исходный азот обнаруживается только в наполовину меченых молекулах в любое время по прошествии одного времени генерации, демонстрирует существование в каждой молекуле ДНК двух субъединиц, содержащих равные количества азота. Обнаружение того, что во втором поколении полумеченые и немеченые молекулы обнаруживаются в равных количествах, показывает, что количество выживших родительских субъединиц вдвое превышает количество исходных родительских молекул. То есть субъединицы сохранены.

    2. После репликации каждая дочерняя молекула получила одну родительскую субъединицу.

    Обнаружение того, что все молекулы ДНК помечены наполовину после одного поколения после добавления N 14 , показывает, что каждая дочерняя молекула получает одну родительскую субъединицу. 14 Если бы родительские субъединицы каким-либо другим образом были разделены среди дочерних молекул, в первом поколении были бы обнаружены несколько полностью меченых и несколько немеченых молекул ДНК, представляющих тех дочерей, которые получили две родительские субъединицы или не получили их, соответственно.

    3. Репликативный акт приводит к удвоению молекул.

    Это утверждение является следствием выводов 1 и 2 выше, согласно которым каждая родительская молекула передает две субъединицы молекулам-потомкам, и каждая молекула-потомок получает только одну родительскую субъединицу. Отсюда следует, что каждый отдельный акт молекулярного воспроизводства приводит к удвоению числа молекул, участвующих в этом акте.

    Приведенные выше выводы схематично представлены на рисунке 5.

    Рис. 5.

    Схематическое изображение выводов, сделанных в тексте на основании данных, представленных на рис. 4. Азот каждой молекулы ДНК делится поровну между двумя субъединицами. После дупликации каждая дочерняя молекула получает одну из них. Субъединицы сохраняются за счет последовательных дупликаций.

    Модель Уотсона-Крика

    Молекулярная структура ДНК была предложена Уотсоном и Криком. 15 Прошла предварительная доработка 16 без изменения основных характеристик и подтверждена физико-химическими исследованиями. 17 Структура состоит из двух полинуклеотидных цепей, спирально намотанных вокруг общей оси. Азотистое основание (аденин, гуанин, тимин или цитозин) на каждом уровне одной цепи связано водородными связями с основанием на том же уровне в другой цепи. Структурные требования допускают наличие только пар оснований с водородными связями аденин-тимин и гуанин-цитозин, что приводит к детальной комплементарности между двумя цепями. Это подсказало Уотсону и Крику 18 определенную и структурно правдоподобную гипотезу дупликации молекулы ДНК.Согласно этой идее, две цепи разделяются, обнажая участки водородных связей оснований. Затем, в соответствии с ограничениями на спаривание оснований, каждая цепь служит шаблоном для синтеза своего комплемента. Соответственно, каждая дочерняя молекула содержит одну из родительских цепей, спаренных с вновь синтезированной цепью (рис. 6).

    Рис. 6.

    Иллюстрация механизма дупликации ДНК, предложенного Уотсоном и Криком. Каждая дочерняя молекула содержит одну из родительских цепей ( черный ) в паре с одной новой цепью ( белый ).При продолжении дупликации две исходные родительские цепи остаются нетронутыми, так что всегда будут обнаруживаться две молекулы, каждая с одной родительской цепью.

    Результаты настоящего эксперимента полностью соответствуют ожиданиям модели Уотсона-Крика для дупликации ДНК. Однако следует подчеркнуть, что не было показано, что молекулярные субъединицы, обнаруженные в настоящем эксперименте, представляют собой одиночные полинуклеотидные цепи или даже что исследуемые здесь молекулы ДНК соответствуют одиночным молекулам ДНК, обладающим структурой, предложенной Уотсоном и Криком.Однако некоторая информация была получена о молекулах и их субъединицах; это кратко излагается ниже.

    Молекулы ДНК, полученные из E. coli путем лизиса под действием детергента, имеют плавучую плотность в CsCl 1,71 г. см. -3 , в области плотностей, обнаруженных для ДНК бактериофагов Т2 и Т4, и для очищенной ДНК тимуса теленка и спермы лосося. Высоковязкий и эластичный раствор ДНК N 14 готовили из додецилсульфатного лизата E.coli по методу Simmons 19 с последующей депротеинизацией хлороформом. Дальнейшую очистку проводили двумя циклами препаративного центрифугирования в градиенте плотности в растворе CsCl. Было обнаружено, что эта очищенная бактериальная ДНК имеет такую ​​же плавучую плотность и кажущуюся молекулярную массу, 7 × 10 6 , что и ДНК целых бактериальных лизатов (фиг. 7, 8).

    Рис. 7.

    Микроденситометр, отслеживающий фотографию поглощения ультрафиолетового излучения, показывающий оптическую плотность в области полосы N 14 E.coli ДНК в равновесии. Около 2 мкг. ДНК, очищенную, как описано в тексте, центрифугировали при 31 410 об / мин при 25 ° в 7,75 моль CsCl при pH 8,4. Градиент плотности практически постоянен по всей области полосы и составляет 0,057 г / см. 4 . Положение максимума указывает на плавучесть 1,71 грамма. см. -3 В этом графике оптическая плотность над базовой линией прямо пропорциональна концентрации ДНК во вращающейся ячейке центрифуги. Максимальная концентрация ДНК составляет около 50 мкг./ мл.

    Рис. 8.

    Квадрат ширины полосы на Рис. 7 в зависимости от логарифма относительной концентрации ДНК. Деления по оси абсцисс отсчитывают интервалы в 1 мм. 2 . В отсутствие неоднородности плотности наклон в любой точке такого графика прямо пропорционален средневесовой молекулярной массе ДНК, расположенной в соответствующем месте полосы. Линейность этого графика указывает на монодисперсность полосатой ДНК. Величина наклона соответствует кажущейся молекулярной массе соли Cs · ДНК, равной 9.4 × 10 6 , что соответствует молекулярной массе 7,1 × 10 6 для натриевой соли.

    Тепловая денатурация

    Было обнаружено, что ДНК из E. coli существенно отличается от очищенной ДНК спермы лосося своим поведением при тепловой денатурации.

    Известно, что воздействие повышенных температур вызывает резкий коллапс относительно жесткой и протяженной молекулы нативной ДНК и делает доступной для кислотно-основного титрования большую часть функциональных групп, которые, как предполагается, заблокированы образованием водородных связей в родная структура. 19, 20, 21, 22 Rice and Doty 22 сообщили, что это коллапс не сопровождается снижением молекулярной массы, определяемой по светорассеянию. Эти результаты подтверждаются центрифугированием в градиенте плотности ДНК спермы лосося. 23 Когда этот материал выдерживают при 100 ° в течение 30 минут либо в условиях, используемых Райсом и Доти, либо в среде для центрифугирования CsCl, это приводит к увеличению плотности на 0,014 г. см. -3 без изменения кажущейся молекулярной массы.Такие же результаты получаются, если ДНК спермы лосося предварительно обрабатывают при pH 6 ЭДТА и додецилсульфатом натрия. Наряду с увеличением плотности нагревание приводит к резкому сокращению времени образования полос в градиенте CsCl. В отсутствие увеличения молекулярной массы уменьшение времени образования полос должно быть приписано 10 увеличению коэффициента диффузии, что указывает на обширный коллапс нативной структуры.

    Наблюдается уменьшение времени образования полос и увеличение плотности, близкое к наблюдаемому при нагревании ДНК спермы лосося (рис.9, A ), когда бактериальный лизат, содержащий однородно меченый N 15 или N 14 ДНК E. coli , выдерживают при 100 ° C в течение 30 минут в среде для центрифугирования CsCl; но кажущаяся молекулярная масса нагретой бактериальной ДНК снижается примерно до половины от ненагретого материала.

    Рис. 9.

    Диссоциация субъединиц ДНК E. coli при тепловой денатурации. Каждая плавная кривая соединяет точки, полученные микроденситометрией фотографии поглощения ультрафиолета, сделанной после 20 часов центрифугирования в растворе CsCl при 44 770 об / мин.Базовая плотность была удалена путем вычитания. A: Смесь нагретого и ненагретого N 15 бактериальных лизатов. Только нагретый лизат дает одну полосу в указанном положении. В этот эксперимент для сравнения добавляли ненагретый лизат. Нагревание привело к увеличению плотности на 0,016 грамма. см. -3 и снижение кажущейся молекулярной массы ДНК примерно на половину. B: Нагретый лизат бактерий N 15 , выращенных для одного поколения в среде роста N 14 .Перед тепловой денатурацией гибридная ДНК, содержащаяся в этом лизате, образует только одну полосу, как можно видеть на фиг. 4. C: Смесь нагретых бактериальных лизатов N 14 и нагретых N 15 . Разница в плотности 0,015 г. см. −3

    Полумеченая ДНК, содержащаяся в детергентном лизате N 15 Клетки E. coli , выращенные в течение одного поколения в среде N 14 , нагревали при 100 ° C в течение 30 минут при центрифугировании CsCl средний.Эта обработка приводит к потере исходного наполовину меченого материала и появлению в равных количествах двух видов новой плотности, каждая из которых имеет примерно половину начальной кажущейся молекулярной массы (фиг. 9, B ). Разница в плотности между двумя видами составляет 0,015 г. см. -3 , что близко к приращению, производимому N 15 мечения ненагретой ДНК.

    Такое поведение предполагает, что нагревание гибридной молекулы вызывает диссоциацию субъединицы, содержащей N 15 , от субъединицы N 14 .Эта возможность была проверена исследованием градиента плотности смеси нагретой ДНК N 15 и нагретой ДНК N 14 (фиг. 9, C ). Близкое сходство между продуктами нагревания гибридной ДНК (фиг.9 B ) и смесью продуктов, полученных в результате нагревания ДНК N 14 и N 15 отдельно (фиг.9, C ), позволяет сделать вывод. что две молекулярные субъединицы действительно диссоциировали при нагревании. Поскольку обнаружено, что кажущаяся молекулярная масса полученных таким образом субъединиц близка к половине от массы интактной молекулы, можно дополнительно сделать вывод, что субъединицы молекулы ДНК, которые сохраняются при дупликации, представляют собой одиночные непрерывные структуры.Тем самым исключается схема дупликации ДНК, предложенная Delbrück 24 .

    Подводя итог, ДНК лосося и E. coli , нагретая в аналогичных условиях, разрушается и претерпевает аналогичное увеличение плотности, но ДНК лосося сохраняет свою первоначальную молекулярную массу, в то время как бактериальная ДНК диссоциирует на две консервативные субъединицы. при дублировании. Эти данные допускают две разные интерпретации. С одной стороны, если предположить, что ДНК лосося содержит субъединицы, аналогичные найденным в E.coli , то мы должны предположить, что субъединицы ДНК лосося связаны между собой более прочно, чем субъединицы ДНК бактерий. С другой стороны, если мы предположим, что молекулы ДНК лосося не содержат этих субъединиц, то мы должны признать, что молекула бактериальной ДНК представляет собой более сложную структуру, чем молекула ДНК лосося. Последняя интерпретация ставит под сомнение достаточность модели ДНК Уотсона-Крика для объяснения наблюдаемого распределения родительских атомов азота среди дочерних молекул.

    Заключение

    Структура ДНК, предложенная Уотсоном и Криком, вызвала ряд предложений относительно того, как такая молекула может реплицироваться. Эти предложения 6 делают конкретные прогнозы относительно распределения родительских атомов среди дочерних молекул. Представленные здесь результаты дают подробный ответ на вопрос об этом распределении и одновременно обращают наше внимание на другие проблемы, решение которых должно стать следующим шагом на пути к полному пониманию молекулярных основ дупликации ДНК.Каковы молекулярные структуры субъединиц ДНК E. coli , которые передаются в неизменном виде каждой дочерней молекуле? Каковы отношения этих субъединиц друг к другу в молекуле ДНК? Каков механизм синтеза и диссоциации субъединиц in vivo?

    Резюме

    С помощью центрифугирования в градиенте плотности мы наблюдали распределение N 15 среди молекул бактериальной ДНК после переноса равномерно замещенного N 15 экспоненциально растущего E.coli в среду N 14 .

    Мы находим, что азот молекулы ДНК делится поровну между двумя физически непрерывными субъединицами; что после дупликации каждая дочерняя молекула получает одну из них; и что субъединицы сохраняются за счет многих дупликаций.

    Footnotes

    • ↵ * При поддержке грантов Национального фонда детского паралича и Национальных институтов здравоохранения.

    • ↵ † № вклада.2344.

    Подготовка проб для вестерн-блоттинга: Novus Biologicals

    ЛИСИС

    Первым шагом в пробоподготовке является выделение белков из их источника. Обычно белки выделяют из клеток или тканей путем лизиса. Лизис разрушает клеточную мембрану, чтобы отделить белки от нерастворимых частей клетки. Ряд буферов для лизиса можно использовать для подготовки образцов для вестерн-блоттинга. Как правило, эти буферы различаются по силе детергентов, выделяющих растворимые белки.Для трудно растворимых белков рекомендуются более сильные детергенты, такие как Triton X-100. См. Список ниже для общих рецептов буфера для лизиса.

    Субклеточная локализация интересующего белка может использоваться в качестве отправной точки для определения оптимального буфера для лизиса для получения высокой чистоты и выхода белка. Белки, обнаруженные преимущественно или исключительно в субклеточном месте, таком как ядро ​​или митохондрии, могут быть обогащены наборами для фракционирования. Это особенно полезно при исследовании слабо экспрессируемых белков.Поскольку каждый белок отличается, условия буфера для лизиса и детергента могут потребовать оптимизации для отдельных экспериментов вестерн-блоттинга. Обратитесь к таблице ниже в качестве отправной точки для выбора буфера для лизиса.

    Рекомендации по буферу для лизиса

    Сотовая связь Рекомендуемый буфер
    ЦЕЛЬНЫЙ ЛИЗАТ КЛЕТОК НП-40
    ЯДЕРНАЯ RIPA, или ядерное фракционирование для увеличения концентрации представляющего интерес белка
    МИТОХОНДРИИ RIPA или митохондриальное фракционирование для увеличения концентрации представляющего интерес белка
    ЦИТОПЛАЗМИЧЕСКИЙ Трис-HCl
    МЕМБРАННО-СВЯЗАННЫЕ БЕЛКИ RIPA (SDS обычно считается жестким и поэтому часто хорошо подходит для трудно солюбилизируемых белков)

    Общие рецепты буфера для лизиса

    Буфер Компоненты
    НП-40 150 мМ NaCl
    1% NP-40 или Тритон X-100
    50 мМ Трис pH 8.0
    RIPA 150 мМ NaCl
    1% NP-40 или Triton X-100
    0,5% дезоксихолат натрия
    0,1% SDS
    50 мМ Трис, pH 8,0
    Трис-HCl 20 мМ Трис-Hcl, pH 7,5

    Ингибиторы протеаз и фосфатаз

    Сразу после лизиса клеток начинают происходить протеолиз, дефосфорилирование и денатурация.Эту активность следует свести к минимуму, готовя образцы на льду или при 4 ° C и добавляя свежие ингибиторы протеаз и фосфатаз в буфер для лизиса.

    Хотя существует множество коммерчески доступных готовых коктейлей с ингибиторами (часто запатентованных), можно приготовить домашнюю смесь в зависимости от индивидуальных потребностей. В таблице ниже перечислены распространенные ингибиторы протеаз и фосфатаз, их мишени и рекомендованная конечная концентрация в буфере для лизиса.

    Общие ингибиторы протеаз и фосфатаз

    Ингибитор

    Цель

    Конечная концентрация

    Апротинин Трипсин, химотрипсин, плазмин 2 мкг / мл
    Лейпептин Лизосомальный 1-10 мкг / мл
    Пепстатин А Аспарагиновые протеазы 1 мкг / мл
    PMSF Сериновые протеазы 1 мМ
    EDTA Металлопротеиназы Mg2 + и Mn2 + 1-5 мМ
    EGTA Са2 + металлопротеиназы 1 мМ
    Фторид натрия Сериновая и треониновая фосфатазы 5-10 мМ
    Ортованадат Тирозинфосфатазы 1 мМ
    Пирофосфат Сериновая и треониновая фосфатазы 1-2 мМ
    B-глицерофосфат Сериновая и треониновая фосфатазы 1-2 мМ

    ПРОВЕДЕНИЕ ЛИЗИСА

    Протокол лизиса клеток может широко варьироваться в зависимости от используемого образца клетки или ткани.Например, для лизиса ткани сердца или мозга мыши может потребоваться гомогенизация, которая обычно включает мгновенное замораживание образца в жидком азоте перед измельчением с помощью ступки и пестика или электрического гомогенизатора. Протокол лизиса следует выбирать на основе стандартных протоколов в данной области для данной ткани. Ниже приводится общий пример протокола лизирования клеток, выращенных в культуре.

    Препарат лизата из культуры клеток

    1. Вымойте чашку для культур клеток на льду ледяным PBS.
    2. Аспирируйте PBS и добавьте ледяной буфер для лизиса (1 мл на конфлюэнтные 107 клеток / 100 мм чашку / 150 см2 колбу). В таблице ниже приведены рекомендации по использованию буфера для лизиса, основанные на субклеточном расположении интересующего белка.
    3. С помощью скребка для клеток соскребите с чашки прикрепленные клетки и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку. При необходимости клетки можно трипсинизировать и промывать PBS перед ресуспендированием в буфере для лизиса.
    4. Встряхивайте клетки в течение 30 минут при 4˚C.
    5. Центрифугируйте смесь клеточных лизатов при 4˚C. Время и сила центрифугирования различаются для каждого типа клеток, но обычно рекомендуется 20 минут при 12 000 об / мин.
    6. Перенести супернатант (лизат) в свежую пробирку на льду.

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИЗАТНОГО БЕЛКА

    Важно определить концентрацию белка в каждом лизате, чтобы обеспечить равную загрузку геля SDS-PAGE на последующих этапах. Равная загрузка позволяет точно определить уровни белков и различия экспрессии с помощью вестерн-блоттинга.Концентрацию белка можно определить, выполнив стандартный анализ Брэдфорда, Лоури или BCA. Образцы белка можно заморозить при -20 ˚C или -80 ˚C для дальнейшего использования или подготовить для загрузки геля для немедленного использования.

    ПОДГОТОВКА ЛИЗАТОВ ДЛЯ ЗАГРУЗКИ ГЕЛЯ

    Эпитоп обычно находится в трехмерной конформации белка. Таким образом, необходимо развернуть или денатурировать белок, чтобы обеспечить доступ к антителу. Денатурацию проводят путем кратковременного кипячения образца в загрузочном буфере, содержащем SDS.

    Наиболее распространенным загрузочным буфером для электрофореза в геле SDS-PAGE является 2X буфер Лэммли. Его также можно приготовить в 4-кратной или 6-кратной концентрации, что может быть полезно при больших объемах лизатов с низкой концентрацией белка.

    Рецепт загрузочного буфера:

    Буфер загрузки Компоненты
    2X буфер Лэммли 4% SDS
    5% 2-меркаптоэтанол
    20% глицерин
    0.004% бромфенолового синего
    0,125 M Трис HCl
    Довести pH до 6,8

    Понимание компонентов буфера загрузки:

    Компонент Банкноты
    SDS Заставляет белки становиться отрицательно заряженными за счет их присоединения к анионам SDS. Обертывание SDS вокруг основы полипептида вызывает денатурацию белка.Отрицательный заряд, придаваемый SDS полипептидным цепям, пропорционален их длине. Благодаря этому белки могут быть разделены электрофорезом в SDS-PAGE согласно их молекулярной массе, а не по собственному электрическому заряду. И загрузочный буфер, и рабочий буфер геля содержат SDS для этого.
    Восстановитель (β-ME или DTT) Далее удаляются третичные и четвертичные структуры за счет уменьшения внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных связей, превращая белки в линейную форму.
    Глицерин Увеличьте плотность образца, чтобы загруженные образцы могли опускаться на дно лунки, способствуя равномерной загрузке белка за счет минимизации переполнения образца из лунки.
    Бромфеноловый синий Позволяет визуализировать миграцию белка во время гель-электрофореза. Из-за своего небольшого размера бромфеноловый синий мигрирует быстрее, чем белки в образцах, и обеспечивает фронт миграции для контроля процесса электрофореза и предотвращения стекания образцов.Бромфеноловый синий — краситель.

    Условия загрузки и работы буфера

    Состояние белка Буфер для загрузки образцов Гелевый беговой буфер
    Редуцированный и денатурированный (чаще всего) SDS + β-ME или DTT SDS
    Уменьшенный и родной β-ME или DTT, без SDS Нет SDS
    Окисленные и денатурированные SDS, без β-ME или DTT SDS
    Окисленные и нативные Без SDS и без β-ME или DTT Нет SDS

    Пробоподготовка для загрузки геля

    1. Определите концентрацию белка в каждом клеточном лизате.
    2. Определите, сколько белка нужно загрузить (рекомендуется: 10-50 мкг / дорожка), и добавьте равный объем 2X буфера Лэммли.
    3. Восстановите и денатурируйте образцы путем кипячения лизатов в буфере для образцов при 95–100 ° C в течение 5 минут. Этот шаг следует пропускать только в том случае, если в таблице данных антител рекомендуются невосстанавливающие или неденатурирующие условия.

    Примечание. Рекомендуются восстановительные / денатурирующие условия, если в таблице данных антител не указано иное. Иногда антитела распознают только эпитопы, поскольку они существуют на поверхности нативного, неденатурированного состояния белка.Неденатурирующие условия могут быть созданы, если оставить SDS вне буферов для образцов и миграции и не кипятить образцы. Кроме того, некоторые антитела распознают белки только в их невосстановленных или окисленных формах. В этом случае восстановители β-меркаптоэтанол (βME) или DTT не должны включаться в буферы. См. Приведенную выше таблицу для ознакомления с инструкциями по загрузке буфера и буфера для прогрева геля.

    Назад к протоколу вестерн-блоттинга

    Микрофлюидная очистка ДНК на основе капель с бактериальных лизатов путем экстракции фенолом

  • Atencia J, Beebe DJ (2005) Контролируемые микрофлюидные интерфейсы.Nature 437: 648–655

    Статья Google ученый

  • Bhattacharyya A, Klapperich CM (2008) Извлечение вирусной РНК из инфицированных клеток млекопитающих на основе микрофлюидики для одноразовой молекулярной диагностики. Актуаторы Sens B 129: 693–698

    Артикул Google ученый

  • Breadmore MC, Wolfe KA, Arcibal IG, Leung WK, Dickson D, Giordano BC, Power ME, Ferrance JP, Feldman SH, Norris PM, Landers JP (2003) Очистка ДНК из биологических образцов с помощью микрочипов.Anal Chem 75: 1880–1886

    Статья Google ученый

  • Chen X, Cui da F, Liu CC (2008) Лизис клеток и экстракция ДНК в режиме онлайн на микрожидкостном биочипе, изготовленном с помощью технологии микроэлектромеханических систем. Электрофорез 29: 1844–1851

    Статья Google ученый

  • Christel LA, Petersen K, McMillan W., Northrup MA (1999) Быстрые автоматизированные анализы зондов нуклеиновых кислот с использованием силиконовых микроструктур для определения концентрации нуклеиновых кислот.J Biomech Eng 121: 22–27

    Статья Google ученый

  • Кристофер Г.Ф., Анна С.Л. (2007) Микрожидкостные методы создания непрерывных потоков капель. J Phys D 40: R319 – R336

    Артикул Google ученый

  • Dreyfus R, Tabeling P, Willaime H (2003) Упорядоченные и неупорядоченные структуры в двухфазных потоках в микроканалах. Phys Rev Lett 90: 144505

    Статья Google ученый

  • Easley CJ, Karlinsey JM, Bienvenue JM, Legendre LA, Roper MG, Feldman SH, Hughes MA, Hewlett EL, Merkel TJ, Ferrance JP, Landers JP (2006) Полностью интегрированная система генетического анализа микрожидкостей с вводом пробы -возможность ответа.Proc Natl Acad Sci USA 103: 19272–19277

    Статья Google ученый

  • Гийо П., Колин А. (2005) Устойчивость параллельных потоков в микроканале после Т-образного перехода. Phys Rev E 72: 066301–066304

    Статья Google ученый

  • Гюнтер А., Йенсен К.Ф. (2007) Многофазная микрофлюидика: от характеристик потока до химического синтеза и синтеза материалов. Lab Chip 7: 935–938

    Артикул Google ученый

  • Hagan KA, Meier WL, Ferrance JP, Landers JP (2009) Диоксид кремния, покрытый хитозаном, в качестве твердой фазы для очистки РНК в микрофлюидном устройстве.Anal Chem 81: 5249–5256

    Статья Google ученый

  • Haubert K, Drier T, Beebe D (2006) Склеивание PDMS с помощью портативной недорогой коронирующей системы. Lab Chip 6: 1548–1549

    Артикул Google ученый

  • Хибара А., Касаи К., Миягути Х., Китамори Т. (2008) Новая концепция управления двухфазным потоком и микрочип многоступенчатой ​​экстракции. В: Материалы 12-й международной конференции по миниатюрным системам для химии и наук о жизни (mTAS 2008), Сан-Диего, Калифорния, стр. 1326–1328

  • Кулински М.Д., Махаланабис М., Гиллерс С., Чжан Дж.Й., Сингх С., Клапперих. CM (2009) Модуль подготовки образцов для бактериального лизиса и выделения ДНК из мочи человека.Биомедицинские микроприборы 11: 671–678

    Статья Google ученый

  • Lagally ET, Emrich CA, Mathies RA (2001) Полностью интегрированная микросистема ПЦР-капиллярного электрофореза для анализа ДНК. Лабораторный чип 1: 102–107

    Артикул Google ученый

  • Legendre LA, Bienvenue JM, Roper MG, Ferrance JP, Landers JP (2006) Простое бесклапанное устройство для микрожидкостной подготовки образцов для экстракции и амплификации ДНК из образцов нанолитрового объема.Anal Chem 78: 1444–1451

    Статья Google ученый

  • Mao X, Yang S, Zahn J (2006) Экспериментальная демонстрация и численное моделирование водно-органической жидкой экстракции, усиленной образованием капель в микрожидкостном канале. В: Proceedings of the ASME-IMECE, IMECE 2006-16084, Chicago, IL

  • Morales M, Zahn J (2008) Разработка микрофлюидного модуля с ограничением диффузии для очистки ДНК посредством экстракции фенолом.В: Proceedings of the ASME-IMECE, IMECE 2008-68086, Boston, MA

  • Qiagen (2003) QIAprep miniprep handbook. Дистрибьюторы Qiagen

  • Reddy V, Zahn JD (2005) Межфазная стабилизация двухфазных микропотоков водно-органического происхождения для миниатюрного модуля экстракции ДНК. J Colloid Interface Sci 286: 158–165

    Статья Google ученый

  • Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Молекулярное клонирование: лабораторное руководство.Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, NY

    Google ученый

  • Shui L, Eijkel JCT, van den Berg A (2007a) Многофазный поток в микро- и наноканалах. Актуаторы Sens B 121: 263–276

    Артикул Google ученый

  • Shui L, Eijkel JCT, van den Berg A (2007b) Многофазный поток в микрофлюидных системах — контроль и применение капель и поверхностей раздела. Adv Colloid Interface Sci 133: 35–49

    Статья Google ученый

  • Sober H, Harte R (1968) Справочник по биохимии отобранных данных для молекулярной биологии.The Chemical Rubber Company, Кливленд, Огайо

    Google ученый

  • Song H, Chen D, Ismagilov R (2006) Реакции в каплях в микрофлюидных каналах. Angew Chem Int Ed 45: 7336–7356

    Статья Google ученый

  • Tian H, Hühmer AFR, Landers JP (2000) Оценка кремнеземных смол для прямого и эффективного извлечения ДНК из сложных биологических матриц в миниатюрном формате.Anal Biochem 283: 175–191

    Статья Google ученый

  • Тайс Дж. Д., Сонг Х., Лион А. Д., Исмагилов Р.Ф. (2003) Образование капель и перемешивание в многофазной микрофлюидике при низких значениях Рейнольдса и капиллярных чисел. Langmuir 19: 9127–9133

    Статья Google ученый

  • Тайс Дж., Лион А., Исмагилов Р. (2004) Влияние вязкости на образование и перемешивание капель в микрожидкостных каналах.Anal Chim Acta 507: 73–77

    Статья Google ученый

  • Вен Дж., Гильо С., Ферранс Дж. П., Ландерс Дж. П. (2007) Микрожидкостная очистка ДНК в двухступенчатом двухфазном микрочипе, содержащем обращенно-фазовый и фотополимеризованный монолит. Anal Chem 79: 6135–6142

    Статья. Google ученый

  • Wu QR, Bienvenue JM, Hassan BJ, Kwok YC, Giordano BC, Norris PM, Landers JP, Ferrance JP (2006) Макропористый золь – гель кремнезем на основе микрочипа для эффективного выделения ДНК из клинических образцов.Anal Chem 78: 5704–5710

    Статья Google ученый

  • Xia Y, Whitesides GM (1998) Мягкая литография. Angew Chem Int Ed 37: 550–575

    Статья Google ученый

  • Xu J, Li S, Tan J, Luo G (2008) Корреляция образования капель в микрожидкостных устройствах с Т-образным соединением: от сжатия до капания.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *